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鸭源新城疫病毒的分离鉴定及其对SPF鸭免疫机能的影响

作　者: 崔京腾
导　师: 刁有祥
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭源新城疫病毒 F基因 HN基因 SPF鸭免疫抑制
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 3次
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内容摘要

鸭新城疫(Duck Newcastle disease)是由新城疫病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，该病以呼吸道、消化道粘膜充血、出血或溃疡，出现扭头、转圈等神经症状为主要特征。传统理论认为新城疫病毒不感染水禽，即使感染也不发病(Bolte et al.,2001)，但1997年王永坤等首次报道从病鹅体内分离到该病毒后，安徽、山东、浙江、福建等地相继报道部分鸭群发生了新城疫（何永强等，2005；张太翔等，2009；陈少莺等，2004；张训海等，2001）。目前该病毒对鸭具有较强的致病性，已经成为危害我国养鸭业的重要疫病之一。本研究2010-2012年在山东、江苏等地发病鸭场进行了病毒的分离鉴定，共分离到6株病毒。按常规方法进行血凝试验、血凝抑制试验，结果表明6株毒株均具有血凝特性，且血凝特性能被NDV阳性血清所抑制，而不被H9N2、H5N1、EDS-76阳性血清所抑制，初步鉴定6株病毒为NDV，分别命名为SD01株、SD02株、SD03株、SD04株、SD05株和JS01株。根据GenBank中发表的鸭源NDV F基因、HN基因序列，共设计合成了5对引物，采用RT-PCR的方法分别对6株病毒的F基因、HN基因核苷酸序列进行扩增和序列分析。结果表明：6株病毒F基因的核苷酸同源性为95.9%-99.9%，与F48E9和LaSota株的核苷酸同源性分别为85.5%-87.4%和83.1%-84.8%。HN基因的核苷酸同源性为97.0%-99.4%，与F48E9和LaSota株的核苷酸同源性分别为83.7%-84.4%和81.0%-81.5%。遗传进化分析表明6株病毒均为基因Ⅶd型，说明目前流行的NDV仍以基因Ⅶd型为主，且分离的毒株与传统疫苗株相比都存在较大的变异。F蛋白氨基酸序列分析表明，裂解位点的氨基酸组成均为112R-R-Q-K-R-F117，具有NDV强毒株的典型分子特征。选用120只30日龄已免疫H5N1禽流感油乳剂灭活疫苗的SPF鸭，随机分为静脉注射组、点眼滴鼻组和对照组，每组40只。接种NDV后观察各组鸭的发病情况及症状，于不同时间随机剖杀试验组和对照组鸭，采集血液检测血液生化和血液常规指标，并测定鸭源NDV对SPF鸭外周血中淋巴细胞转化率和H5N1油乳剂灭活疫苗HI抗体效价的影响以及CD4+/CD8+的动态变化；采集脾脏、法氏囊，按常规方法制备石蜡切片、HE染色，观察病理组织学变化，TUNEL法检测脾脏、法氏囊细胞凋亡情况；以分析不同处理组鸭源NDV对SPF鸭免疫机能的影响。结果表明：攻毒后，试验组SPF鸭发病率为100%，死亡率为32.5%，并出现呼吸困难，肺脏出血，腺胃乳头出血等症状及剖检变化；血常规检测结果显示，鸭源NDV静脉注射组和点眼滴鼻组血液中RBC、HGB先降低后显著升高，PLT、WBC显著降低且均与对照组差异显著（P＜0.05）；血液生化检测结果显示，ALT、AST、LDH、CK、AMY活性升高而TP含量降低，静脉注射组和点眼滴鼻组与对照组相比差异显著(P＜0.05）或极显著(P＜0.01）；静脉注射组和点眼滴鼻组的H5N1油乳剂灭活疫苗HI抗体效价要比对照组低但差异不显著，淋巴细胞转化率与对照组相比降低且差异显著（P＜0.05）；静脉注射组与点眼滴鼻组的CD4+/CD8+变化趋势基本一致，均为先升高后降至正常水平以下；病理组织学病变以脾脏出血、坏死，法氏囊间质增宽、淋巴滤泡内淋巴细胞数量减少为特征；TUNEL法检测脾脏、法氏囊均出现细胞凋亡。因此，SPF鸭接种鸭源NDV后能引起免疫抑制。

全文目录

符号说明  4-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1 引言  12-30
  1.1 NDV 的一般生物学特性  12-14
    1.1.1 NDV 的分类与结构  12-13
    1.1.2 NDV 的理化特性  13
    1.1.3 NDV 的培养特性  13
    1.1.4 NDV 的毒力与致病性  13-14
    1.1.5 NDV 的流行病学  14
  1.2 NDV 的分子生物学特性  14-20
    1.2.1 NDV 的基因组  14-15
    1.2.2 NDV 基因组的演化  15-16
    1.2.3 NDV 的结构蛋白  16-20
  1.3 鸭新城疫的诊断  20-22
    1.3.1 病毒的分离  20
    1.3.2 血清学诊断技术  20-21
    1.3.3 分子生物学诊断技术  21-22
  1.4 NDV 的防治  22-24
    1.4.1 活疫苗  23
    1.4.2 灭活苗  23
    1.4.3 基因工程疫苗  23-24
  1.5 NDV 对鸭免疫系统的影响  24-29
    1.5.1 鸭的免疫系统  24-26
    1.5.2 免疫器官的细胞凋亡  26-27
    1.5.3 体液免疫  27-28
    1.5.4 细胞免疫  28-29
  1.6 研究的目的与意义  29-30
2 材料与方法  30-42
  2.1 材料  30-33
    2.1.1 病料与试验动物  30
    2.1.2 仪器和试剂  30-31
    2.1.3 主要试剂的配制  31-32
    2.1.4 引物设计  32-33
  2.2 方法  33-42
    2.2.1 鸭 NDV 的分离与鉴定  33-37
    2.2.2 鸭 NDV 对 SPF 鸭免疫机能的影响  37-42
3 结果  42-58
  3.1 鸭 NDV 的分离与鉴定  42-49
    3.1.1 鸭 NDV 的分离  42
    3.1.2 血凝与血凝抑制试验  42
    3.1.3 鸭 NDV F 基因、HN 基因 RT-PCR 扩增及序列分析  42-49
  3.2 鸭 NDV 对 SPF 鸭免疫机能的影响  49-58
    3.2.1 鸭胚半数致死量（ELD50）测定  49-50
    3.2.2 攻毒后症状及剖检变化  50-51
    3.2.3 血常规检测  51-52
    3.2.4 血液生化指标检测  52-53
    3.2.5 H5N1 禽流感油乳剂灭活疫苗 HI 抗体效价的检测  53-54
    3.2.6 鸭源 NDV 对 SPF 鸭外周血淋巴细胞转化率的影响  54
    3.2.7 鸭源 NDV 攻毒后 SPF 鸭外周血中 CD4+/CD8+的变化  54-55
    3.2.8 免疫器官的病理组织学变化  55-56
    3.2.9 脾脏与法氏囊的细胞凋亡检测结果  56-58
4 讨论  58-61
  4.1 鸭 NDV 的分离与鉴定  58-59
  4.2 鸭 NDV 对 SPF 鸭免疫机能的影响  59-61
5 结论  61-62
参考文献  62-71
致谢  71-72
攻读硕士学位期间发表论文情况  72

鸭源新城疫病毒的分离鉴定及其对SPF鸭免疫机能的影响

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