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青岛地区兔源克雷伯氏杆菌的分离鉴定及分子多样性分析

作　者: 王召朋
导　师: 柴同杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 兽医
关键词: 兔源克雷伯氏杆菌分离鉴定多样性分析
分类号: S858.291
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

克雷伯氏杆菌病(Klebsiellasis)是由肠杆菌科克雷伯氏杆菌属细菌引起的一种急性的人兽共患传染病,该病常发生于多种家禽、家畜和野生动物。肺炎克雷伯氏菌属肠杆菌科克雷伯氏属,是一种常见的条件性致病菌,广泛分布于动物的消化道、消化道以及水、土壤和谷物中,可引起人畜发生肺炎、腹膜炎、子宫炎以及腹泻,甚至发生败血症。但是长期以来,克雷伯氏菌病作为一种条件性致病菌被认为对畜禽危害不大,因而一直未引起人们的重视。近年来现代养殖业生产方式得到迅猛发展,但由于养殖户的管理水平、养殖场的硬软件设施跟不上规模扩大的需要等原因,已经有多起有该菌引起的不同家畜、家禽感染的报道,但是有关兔群感染克雷伯氏杆菌的报道却鲜有出现,而随着我国养兔业的发展养兔方式由零散、少量饲养向区域饲养、规模养殖方向发展,大规模、高密度、通风不良等导致家兔呼吸道疾病呈现上升的趋势。而且青岛地区某兔场在2011年入冬后,部分母兔及仔兔发生腹泻病死亡,临床症状疑似为克雷伯氏杆菌病。为此,开展关于克雷伯氏杆菌病的研究对该病的防控具有重要的现实意义。本研究通过对克雷伯氏杆菌的分离鉴定及多样性分析角度对该病进行了系统深入的研究,为该病的有效治疗和防控提供了基本的资料。本研究对发病兔场的5个兔舍30例病死兔进行解剖,采集肝脏、脾脏、肺脏和心血分为两份,一份病料分离培养并做相应涂片,进行细菌性检查和生理生化鉴定,并进行动物回归性试验和药物敏感性试验,从而进一步确定细菌性病原菌的种类,筛选有效治疗该病的抗生素；另一份用于DNA提取,采用ERIC-PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction, ERIC-PCR)技术,获得克雷伯氏杆菌的ERIC-PCR指纹图谱,并用NTSYS-pc (Version2.10)软件进行分析,从而进一步对克雷伯氏杆菌的分子生物学多样性进行分析。结果显示：通过对从30例病死兔中发现有24例的心血涂片可看到短粗直杆菌。革兰氏染色阴性；用碱性美蓝染色后菌体两极浓染,有荚膜,无芽孢；用墨汁染色可看见明显荚膜。该病原菌培养特性、生化反应特性试验结果表明,该菌株为兔肺炎克雷伯氏杆菌。将该菌进行纯培养,用PBS稀释纯培养菌液腹腔接种小白鼠,结果接种量为0.3m1/只的小鼠,最先出现死亡,接种后3-7小时全部死亡,接种量0.2m1/只的小鼠,接种后5-12h全部死亡。剖检,可见死亡小鼠出现与病死兔相似的病理变化,动物回归实验结果表明该分离菌株具有强致病性,且临床兔发生死亡的原因为肺炎克雷伯氏菌感染。药敏实验结果表明,该菌仅对诺氟沙星和强力霉素2种药物敏感,对大多数抗菌药物产生耐药性。用ERIC-PCR方法对24例临床分离菌株进行扩增,均能产生明显的条带,最小的条带为280bp左右,最大条带为3000bp,得到了不同的指纹图谱,并采用NTSYS-pc软件对进行聚类树分析,24株临床分离的克雷伯氏杆菌分为14个基因型,分别记为A-N,其中基因A型(R1、R9、R12和R14)占16.67%(4/24),即基因A型菌为优势菌；其次是基因B、C、D、F、G、J和K型均占8.33%(2/24)；基因E、G、I、L、M和N型所占比例均为4.17%(1/24)。从分析结果可以看出基因A型克雷伯氏杆菌是引起该兔场兔群发病的优势菌,其次为基因B、C、D、F、G、J和K型,本研究结果为克雷伯氏杆菌病的防控研究提供了科学依据。本研究的结论为：本研究采用常规细菌性试验、生化鉴定试验和ERIC-PCR技术对山东省青岛地区发病兔场的病死兔的死亡原因进行研究,确定了引起该兔场发病的细菌性病原菌—克雷伯氏杆菌,筛选出了诺氟沙星和强力毒素等敏感性药物,为该病的有效防控和治疗提供了有利的理论依据；利用ERIC-PCR方法分析了该地区兔源克雷伯氏杆菌的分子多样性,从而为进一步研究该细菌提供了新的理论依据。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-28
  1.1 克雷伯氏菌病的病原特性  13-15
    1.1.1 形态  14
    1.1.2 培养特性  14
    1.1.3 生化反应  14
    1.1.4 血清型鉴定  14
    1.1.5 宿主  14-15
  1.2 克雷伯氏菌病的流行病学  15-17
    1.2.1 禽克雷伯氏菌病  15-16
      1.2.1.1 克雷伯氏菌病流行特点  15-16
      1.2.1.2 禽克雷伯氏菌病的临床症状和剖检变化  16
    1.2.2 家畜克雷伯氏菌病  16-17
      1.2.2.1 猪克雷伯氏菌病  16-17
      1.2.2.2 牛克雷伯氏菌病  17
      1.2.2.3 羊肺炎克雷伯氏菌病  17
    1.2.3 野生动物的克雷伯氏菌病  17
  1.3 克雷伯氏杆菌的分子多样性分析检测技术  17-19
    1.3.1 实时荧光定量PCR  18
    1.3.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)分析  18-19
    1.3.3 ERIC-PCR技术  19
  1.4 ERIC-PCR技术特点及其应用  19-22
    1.4.1 ERIC序列  19-20
    1.4.2 ERIC结构特征及功能  20
    1.4.3 ERIC-PCR的原理及特点  20-21
    1.4.4 ERIC-PCR产物形成规律  21
    1.4.5 ERIC-PCR技术的应用  21-22
  1.5 克雷伯氏杆菌耐药性研究  22-24
    1.5.1 不同地区克雷伯氏杆菌的耐药性  22-23
    1.5.2 克雷伯氏杆菌耐药性产生的原因  23-24
  1.6 克雷伯氏杆菌的研究进展  24-25
    1.6.1 人的感染  24-25
    1.6.2 多种动物的感染  25
      1.6.2.1 家畜家禽类  25
      1.6.2.2 野生动物  25
      1.6.2.3 水产品类  25
  1.7 本研究的目的及意义  25-26
  1.8 技术路线  26-28
2 材料和方法  28-40
  2.1 试验材料  28-33
    2.1.1 病料来源  28
    2.1.2 主要仪器  28
    2.1.3 主要工具酶及试剂  28-29
    2.1.4 培养基及主要溶液的配制  29-33
      2.1.4.1 培养基的配制  29-32
      2.1.4.2 主要溶液的配制  32-33
  2.2 试验方法  33-40
    2.2.1 兔源克雷伯氏杆菌的分离鉴定  33-37
      2.2.1.1 病料的采集和处理  33
      2.2.1.2 细菌学检查  33
      2.2.1.3 细菌分离培养  33-34
      2.2.1.4 生化鉴定  34-36
      2.2.1.5 动物试验  36
      2.2.1.6 药敏实验  36-37
    2.2.2 病原菌的分子多样性分析  37-40
      2.2.2.1 总DNA提取  37-38
      2.2.2.2 提取基因组DNA的测定  38
      2.2.2.3 ERIC-PCR方法  38-40
3 结果及分析  40-45
  3.1 细菌学检查  40-41
  3.2 细菌培养  41-42
  3.3 生化鉴定  42-43
  3.4 动物实验结果  43
    3.4.1 动物发病急解剖情况  43
    3.4.2 细菌分离结果  43
  3.5 药敏实验  43-44
  3.6 总DNA的提取  44
  3.7 ERIC-PCR反应的最优条件  44
  3.8 兔源克雷伯氏杆菌的ERIC-PCR分析结果  44-45
4 讨论  45-47
  4.1 兔源克雷伯氏菌病的病因及发病特点  45-46
  4.2 青岛地区兔源克雷伯氏菌病感染情况  46
  4.3 药敏实验及耐药性分析  46-47
  4.4 ERIC-PCR对青岛地区兔源克雷伯氏杆菌的分子多样性的分析  47
5 结论  47-48
参考文献  48-54
致谢  54

青岛地区兔源克雷伯氏杆菌的分离鉴定及分子多样性分析

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