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牛分枝杆菌MPT63蛋白的表达、纯化及其免疫学活性的初步探究

作　者: NAGEB AZEM ESSOWANI
导　师: 朱鸿飞
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医
关键词: 牛结核分枝杆菌 MPT63 T细胞活性 B细胞活性
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 5次
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内容摘要

牛结核病(bovine tuberculosis)是一种非常重要的人畜共患传染病,主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)感染引起,可以通过吸入含菌的气溶胶或食用未经消毒的牛奶传染给人。牛结核病的防治和彻底根除需要灵敏、有效的诊断方法,目前广泛应用的皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验均依赖于PPD作为刺激源,存在检测特异性不高的缺陷。近年来,为了提高检测的特异性,寻找PPD替代刺激源的研究成为了热点。通过比较致病性分枝杆菌和非致病性分枝杆菌基因组,人们发现RD区基因存在差异,因此RD区蛋白有望替代PPD用于区分致病性分枝杆菌与非致病性分枝杆菌感染。我们利用原核表达系统构建表达了牛分枝杆菌抗原MPT63,并通过镍柱亲和层析进行纯化,纯化后的蛋白置换到PBS缓冲系统并用Triton X-114去除内毒素,得到纯度在95%以上、内毒素含量在2EU/mg以下的重组蛋白。我们通过IFN-γ释放试验、豚鼠皮内变态反应试验和牛皮内变态反应试验评价重组蛋白的T细胞活性。结果显示MPT63不能引起灭活牛分枝杆菌致敏豚鼠的DTH反应,但是可以特异性刺激结核病阳性牛T淋巴细胞释放一定水平的IFN-γ,具有一定的T细胞活性,有作为CE补充抗原的潜力。由于市场上缺少牛结核病阳性标准血清,且不同的牛分枝杆菌感染个体会针对不同的抗原产生抗体,因此我们从临床筛选了367份结核病阳性牛血清和47份阴性健康牛血清,通过间接ELISA方法分析重组蛋白MPT63的B细胞活性。结果显示该重组蛋白具有一定的B细胞活性,但以该重组蛋白建立的间接ELISA检测方法的检出率仅为3.15-47.5%。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-9
Abbreviated table  9-10
Chapterl Introduction  10-17
  1.1. The importance of bovine tuberculosis  10-11
  1.2. Diagnostic methods for bovine TB  11-13
    1.2.1 Bacterial detection  11-12
    1.2.2 PCR detection method  12
    1.2.3 Tuberculin skin test  12
    1.2.4 Serological diagnosis  12-13
    1.2.5 IFN-γ release test  13
  1.3. M. bovis specific protein in the diagnosis of tuberculosis  13-15
    1.3.1 CFP10-ESAT6 protein in the diagnosis of tuberculosis  13-15
    1.3.2 MPT63 protein characteristics  15
  1.4. The purpose of this study and significance  15-17
ChapterⅡ The Expression and Perfectionist of MPT63  17-26
  2.1 Materials  17-19
    2.1.1 Bacteria and vectors  17
    2.1.2 Main reagent supplies  17
    2.1.3 The test solution and configuration methods  17-19
    2.1.4 The Major equipment  19
  2.2 Method  19-24
    2.2.1 Extraction of genomic DNA of Mycobacterium bovis  19-20
    2.2.2 Design of primers  20
    2.2.3 PCR amplification  20-21
    2.2.4 Construction of recombinant plasmids  21-22
    2.2.5 Protein expression and purification  22
    2.2.6 Analysis of target protein  22-23
    2.2.7 Target protein purification  23-24
  2.3 Results and Analysis  24-25
    2.3.1 PCRAmplified gene  24
    2.3.2 Expression and purification of MPT63  24-25
  2.4 Discussion  25-26
ChapterⅢ T cell activity identification  26-32
  3.1. Experimental material  26-27
    3.1.1 Experimental animals  26
    3.1.2 Main reagent supplies  26
    3.1.3 The main equipment  26-27
  3.2. Methods  27-29
    3.2.1 Screening of experimental animals  27
    3.2.2 T cell activity analysis of MPT63 by IGRA  27-28
    3.2.3 T cell activity analysis of MPT63 by skin test  28-29
  3.3. Results and Analysis  29-31
    3.3.1 T cell activity analysis of MPT63 by IGRA  29-30
    3.3.2 T cell activity analysis of MPT63 by skin test  30-31
  3.4. Discussion  31-32
ChapterⅣ B-cell activity identification  32-37
  4.1 Experimental materials  32-33
    4.1.1 Main reagents supplies  32
    4.1.2 Main reagents configuration  32
    4.1.3 Major equipment  32-33
  4.2 Method  33-34
    4.2.1 Serum collection  33
    4.2.2 Indirect ELISA for detection of MPT63 B cell activity  33
    4.2.3 Indirect ELISA for detection cutoff value determines  33-34
    4.2.4 Indirect ELISA for detection of clinical detection effect  34
  4.3 Results and Analysis  34-35
    4.3.1 Cutoff value  34
    4.3.2 Cutoff value  34-35
  4.4 Discussion  35-37
ChapterⅤ Conclusions  37-38
References  38-44
Acknowledgements  44-45
Resume  45

牛分枝杆菌MPT63蛋白的表达、纯化及其免疫学活性的初步探究

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