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环形泰勒虫TaSP基因的克隆、原核表达及PCR诊断方法的建立
作 者: 郑进峰
导 师: 李奎
学 校: 河南农业大学
专 业: 兽医
关键词: 环形泰勒虫 TaSP基因 克隆 表达 PCR 诊断方法
分类号: S858.23
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
牛环形泰勒虫病又称热带泰勒病,是由泰勒科泰勒虫属的环形泰勒虫感染牛引起的一种以高热、贫血、出血和体表淋巴结肿大为主要临床症状的蜱传性血液原虫病。本病流行区域广泛,是危害牛最严重的寄生虫病之一。环形泰勒虫的裂殖体表面蛋白(TaSP),其序列高度保守,而且具有较好的免疫原性,可作为诊断和预防环形泰勒虫病的理想抗原。本研究参考GenBank上登录的环形泰勒虫TaSP基因序列设计引物,采用PCR技术从肃北县环形泰勒虫感染牛的全血基因组中扩增到TaSP基因保守区片段,该基因片段长度为396bp,编码312个氨基酸。序列分析表明,该基因与其他9个GenBank中发表的核苷酸序列相似性为83%~94%。遗传演化关系分析表明,环形泰勒虫肃北株与土耳其株、临潭株、内蒙株、摩洛哥株、苏丹株、宁夏珠及德国株处于同一进化分支,与新疆株和突尼斯株进化途径差异较大。在上述研究基础上,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1/TaSP,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting分析。结果表明,pGEX-4T-1/TaSP在大肠杆菌BL21中成功表达出约41KDa的融合蛋白,能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性。根据该基因片段的核苷酸序列推导出氨基酸序列,应用DNAstar Protean软件提供的模块,用Gamier-Robson法从氨基酸残基的晶体结构来预测蛋白质的二级结构,分别按Kyte-Doolittle、Emini、Karplus-Schulz和Jameson-Wolf方案预测其亲水性、表位可能性、柔韧性和抗原性指数。结果显示,TaSP蛋白在10~19,26~36,49~57,73~86,125~130等区域结果一致,各项指标均较高。此外,上述区域在二级结构上含有易形成抗原表位的无规则卷曲结构,因此B细胞表位可能存在于上述区域内。本研究为实验确定TaSP蛋白的B细胞表位和反向疫苗学研究提供了理论基础。根据TaSP基因序列保守区设计引物建立环形泰勒虫快速PCR诊断方法,特异性实验显示,在被检测的9个样本中,只有环形泰勒虫基因组模版中扩增出了符合大小的特异核酸片段。敏感性试验结果表明,PCR对环形泰勒虫的扩增效率可达到10-10。通过对150份血清样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异性强、敏感度高等特点,适用于牛环形泰勒虫病的检测。
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全文目录
致谢 4-8 摘要 8-9 第一章 环形泰勒虫病研究进展 9-18 1 环形泰勒虫病 9-11 1.1 病原形态 9 1.2 生活史 9 1.3 流行病学 9-10 1.4 临床症状 10 1.5 病理变化 10-11 2 环形泰勒虫病诊断方法的研究进展 11-14 2.1 病原体显微镜检测方法 11 2.2 血清学诊断方法 11-13 2.3 分子生物学诊断方法 13-14 3 环形泰勒虫主要膜蛋白研究进展 14-17 4 本课题研究的目的意义 17-18 第二章 环形泰勒虫 TaSP 基因的克隆、原核表达和蛋白纯化 18-36 1 前言 18 2 材料与方法 18-30 2.1 实验材料 18-21 2.1.1 菌种质粒、虫体和血清: 18 2.1.2 克隆载体和表达载体 18 2.1.3 酶和试剂 18-19 2.1.4 培养基 19 2.1.5 主要仪器 19 2.1.6 主要试剂的配制 19-21 2.2 试验方法 21-30 2.2.1 环形泰勒虫血样的获取和基因组 DNA 的提取 21-22 2.2.2 PCR 扩增目的片段 22-24 2.2.3 目的基因的克隆 24 2.2.4 重组质粒的提取与鉴定 24-25 2.2.5 表达载体的构建与鉴定 25-30 3 结果 30-35 3.1 目的基因的 PCR 扩增 30-31 3.2 pGEM/TaSP 重组质粒鉴定 31 3.3 pGEX-4T-1/TaSP 重组表达质粒的鉴定 31-32 3.4 重组质粒的测序鉴定及序列分析 32-33 3.5 表达产物的 SDS-PAGE 33-34 3.6 蛋白质的纯化 34 3.7 表达产物的 Western-blotting 34-35 4 讨论 35-36 第三章 环形泰勒虫 TaSP 蛋白的二级结构及其 B 细胞抗原表位预测 36-40 1 材料和方法 36-37 1.1 环形泰勒虫 TaSP 蛋白的氨基酸序列 36 1.2 TaSP 蛋白二级结构元件的预测和分析 36 1.3 TaSP 蛋白抗原性表位的预测 36-37 2 结果 37-38 2.1 TaSP 蛋白二级结构的预测 37 2.2 TaSP 蛋白的亲水性分析 37 2.3 TaSP 蛋白的表面可能性分析 37-38 2.4 TaSP 蛋白骨架区柔韧性分析 38 2.5 TaSP 蛋白 B 细胞抗原表位的预测分析 38 2.6 综合性分析 38 3 讨论 38-40 第四章 环形泰勒虫病 PCR 诊断方法的建立 40-44 1 材料 40 1.1 虫种与菌株 40 1.2 主要试剂 40 2 方法 40-41 2.1 目的基因的 PCR 扩增 40-41 2.2 特异性试验 41 2.3 敏感性试验 41 2.4 临床样品检测 41 3 结果 41-43 3.1 牛环形泰勒虫 TaSP 基因的扩增 41-42 3.2 PCR 特异性实验 42 3.3 PCR 灵敏度试验 42 3.4 临床样本的检测 42-43 4 讨论 43-44 结论 44-45 参考文献 45-53 英文摘要 53-54
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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