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蛋鸡禽白血病J亚群流行病学调查及致病性研究

作　者: 蔡黎明
导　师: 成子强
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 禽白血病病毒J亚群流行病学调查分离鉴定致瘤谱 FQ-PCR
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

J亚群禽白血病病毒是由（Subgroup J Avian Leukosis Virus）是1988年英国科学家Payne首先在肉鸡中发现的，主要引起以髓细胞瘤和其他细胞恶性肿瘤为特征的传染性肿瘤性疾病。我国于1999年首次从肉鸡中发现该病毒，2004年从蛋鸡中发现该病毒，之后陆续从地方品种鸡中发现。ALV-J自发现以来，宿主范围不断扩大，感染鸡的发病日龄逐渐提前，致死率不断升高，诱导的肿瘤型越来越多，病毒重组也时有发生。为了了解山东省地区ALV-J在蛋鸡群的流行状况、致病特点及相关宿主因素，本研究对山东省范围内的父母代蛋种鸡场进行ALV-J的血清和分子流行病学调查、病毒在自然感染蛋鸡体内的致瘤性观察及宿主受体、原癌基因和内源性ALV基因表达检测，初步得到的结果如下：从山东省选取了22家父母代蛋种鸡场和4家商品代蛋鸡场，共采集活体样本83只，血清2740份实际检测数为2350份；通过ELISA技术检测血清抗体发现，蛋鸡群中ALV-J抗体平均阳性率在8.3%，鸡群感染阳性率为65%（17/26），在这些ALV-J抗体阳性的蛋鸡群中，海兰褐等进口鸡群抗体平均阳性率为3%，相对较低；中国地方品种，如麻鸡、乌鸡等抗体阳性率为26.7%，相对较高；火鸡群抗体阳性率为2.5%。取活体样本的组织，研磨、无菌处理后接到DF-1细胞，维持7天后应用ELISA方法检测细胞上清中的p27抗原，然后应用PCR检测和克隆测序进行鉴定。结果显示，在83份活体样本中有12份p27阳性，10株是ALV-J，有2株是ALV-C gp85、ALV-E gp37和ALV-J非编码区的多重重组毒株，而且这两株毒株是从两个不同地点不同品种的鸡群中分离到的，说明我国蛋鸡群中已经出现ALV-C亚群。对这10株ALV-J分离株的gp85、gp37、rTM、DR1、E元件、U3、R、U5基因序列进行序列同源性和遗传进化分析显示：分离到的10株ALV-J来源于美国标准株ADOL-7501株和英国原型株HPRS-103，其中有6株ALV-J与美国标准株ADOL-7501亲缘关系最近，有4株ALV-J与英国原型株HPRS-103亲缘关系最近。另外，10株ALV-J的DR1、R和U5区基因非常保守，gp85、gp37、E元件和U3区基因变异性较强，而且变异性与病毒宿主的品系密切相关。分离到2株罕见的ALV-C、ALV-E和ALV-J多重重组毒株，通过对gp85、gp37及3’UTR和3’LTR基因序列进行序列同源性和进化分析发现：重组毒株的gp85基因与ALV-C原型株的gp85基因同源性为92.2%和92.1%，gp37与ALV-E（ev-1）的gp37基因同源性为997.2%和97.6%，3’UTR和3’LTR与ALV-J(HPRS-103)的同源性为96%-100%，而且两株毒株的基因同源性高达99%，结合这两株重组病毒的来源初步和比例推断该重组毒株和ALV-C目前已经具有一定的流行和传播。通过组织病理学观察分离到的12株ALV-J在自然感染蛋鸡中的致病性和诱导的肿瘤谱，发现：ALV-J诱发的肿瘤型主要以髓细胞瘤（7/10）、淋巴细胞瘤(5/10)和血管瘤(4/10)，其次为成红细胞瘤、胆管癌和纤维肉瘤，并且在同一只鸡体内呈现多种肿瘤型，说明ALV-J在蛋鸡群中仍具有多潜能致瘤性。用荧光定量PCR技术对ALV-J自然感染的肿瘤携带鸡体内ALV-J负载量，chNHE1蛋白、原癌基因c-myc、抑癌基因P53和内源性病毒EAV-0、E51的表达量进行检测，明确ALV-J的致病、致瘤性，ALV-J的负载量和chNHE1蛋白，原癌基因c-myc，抑癌基因P53，内源性病毒EAV-0、E51的表达量之间的关系。结果显示，ALV-J自然感染蛋鸡体内，ALV-J的负载量是SPF鸡的3-80万倍，chNHE1蛋白、c-myc、p53、EAV-0、E51大量表达，并且呈现随ALV-J负载量升高而上升的趋势，另外，发生肿瘤的组织中chNHE1蛋白表达量相对偏高。ALV-J负载量与chNHE1表达量呈正相关表明chNHE1蛋白在ALV-J感染宿主细胞、早期组织损伤和后期肿瘤形成的过程中发挥重要作用；ALV-J感染机体后能够激活机体c-myc、p53基因并高量表达，与肿瘤的形成、转移等密切相关；ALV-J激活内源性病毒EAV-0、E51的表达为内、外源性ALV的重组创造了条件。本研究结合血清学、分子流行病学发现ALV‐J在蛋鸡群中仍然具有较高的流行和传播，在蛋鸡体内ALV‐J的gp85、gp37、E元件和U3区基因发生了较大的变异，DR1、R和U5区基因仍然非常保守,并且ALV-J在蛋鸡体内也具有多潜能致瘤性；ALV-J的感染、致瘤等与chNHE1、c-myc、p53、EAV-0、E51的表达密切相关。通过本研究对ALV-J的流行和致病性有了深入的了解，为致病机理的深入研究提供科学依据。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-20
  1.1 ALV-J 病原学  12-13
    1.1.1 ALV 亚群分类  12
    1.1.2 ALV-J 的病毒及基因组结构  12-13
  1.2 ALV-J 的流行病学研究概括  13-14
  1.3 ALV-J 的致病性  14-15
  1.4 ALV-J 的诊断和防控  15
    1.4.1 ALV-J 的诊断  15
    1.4.2 ALV-J 的防控  15
  1.5 ALV-J 受体-CHNHE1 蛋白  15-16
  1.6 原癌基因 C-MYC 和 C-MYB  16-18
  1.7 抑癌基因 P53  18
  1.8 本研究的目的和意义  18-20
2 材料与方法  20-26
  2.1 ALV-J 血清流行病学及分子流行病学调查  20-23
    2.1.1 主要试剂及仪器  20
    2.1.2 细胞、毒株、菌株  20-21
    2.1.3 样品采集  21
    2.1.4 ALV-J 抗体检测  21
    2.1.5 REV 抗体检测  21
    2.1.6 ALV-J 的分离和鉴定  21-23
      2.1.6.1 病毒培养  21
      2.1.6.2 ELISA 检测 ALV 抗原 P27  21
      2.1.6.3 提取前病毒基因组 DNA  21-22
      2.1.6.4 ALV-J、REV 和 MLV 的 PCR 检测  22
      2.1.6.5 gp85、gp37、3’UTR 和 3’LTR 基因分离及克隆测序  22-23
      2.1.6.6 gp85、gp37、3’UTR 和 3’LTR 基因序列比较分析  23
  2.2 ALV-J 在自然感染蛋鸡中致瘤普观察  23-24
    2.2.1 主要试剂及仪器  23
    2.2.2 病料来源  23
    2.2.3 组织病理学观察  23
    2.2.4 血液学观察  23-24
      2.2.4.1 全血分析  23
      2.2.4.2 血涂片、骨髓涂片观察  23-24
  2.3 ALV-J 感染机体内病毒负载量、CHNHE1 蛋白、C-MYC、P53 及 EAV-0、E51 表达量的检测  24-26
    2.3.1 主要试剂及仪器  24
    2.3.2 材料来源  24
    2.3.3 荧光定量 PCR 引物的设计与合成  24-25
    2.3.4 组织 RNA 的提取和 cDNA 的合成  25
    2.3.5 常规 PCR 检测  25
    2.3.6 ALV-J 自然感染蛋鸡体内 ALV-J 负载量、chNHE1 蛋白、c-myc、p53 和 EAV-0、E51表达量检测  25-26
    2.3.7 ALV-J 人工感染鸡体内 ALV-J 负载量、chNHE1 蛋白表达量检测  26
      2.3.7.1 人工接种 SPF 鸡胚及雏鸡排毒检测  26
      2.3.7.2 ALV-J 负载、chNHE1 蛋白表达量检测  26
3 结果与分析  26-67
  3.1 ALV-J 血清流行病学和分子流行病学的调查  26-51
    3.1.1 样品采集  26
    3.1.2 血清学检测  26
    3.1.3 ALV-J 的分离与鉴定  26-51
      3.1.3.1 P27 抗原及 PCR 检测  26-27
      3.1.3.2 env、3’UTR 和 3’LTR 基因的分离  27-30
      3.1.3.3 env、3’UTR 和 3’LTR 基因碱基序列分析  30-51
  3.2 ALV-J 在自然感染蛋鸡中的致瘤谱观察  51-60
    3.2.1 组织病理学观察  51-58
    3.2.2 全血分析  58
    3.2.3 血涂片观察  58-60
  3.3 ALV-J 感染鸡体内病毒负载量、CHNHE1 蛋白、C-MYC、P53 及 EAV-0、E51 表达量的检测  60-67
    3.3.1 常规 PCR 检测  60
    3.3.2 ALV-J 自然感染蛋鸡体内 ALV-J 负载量、chNHE1 蛋白、c-myc、p53 和 EAV-0、E51表达量检测  60-67
      3.3.2.1 引物溶解曲线、扩增曲线分析  61
      3.3.2.2 ALV-J 自然感染蛋鸡肾脏病毒负载的检测  61-62
      3.3.2.3 ALV-J 受体-chNHE1 蛋白表达量的检测  62-63
      3.3.2.4 ALV-J 人工感染蛋鸡体内 ALV-J 负载量、chNHE1 蛋白表达量检测  63-64
      3.3.2.5 原癌基因 c-myc 表达量的检测  64-65
      3.3.2.6 抑癌基因 P53 表大量的检测  65-66
      3.3.2.7 内源性病毒 EAV-0 表大量的检测  66
      3.3.2.8 内源性病毒 EAV-E51 表达量检测  66-67
4 讨论  67-74
  4.1 ALV-J 血清流行病学与分子流行病学的调查  67-70
  4.2 ALV-J 自然感染鸡体内致瘤普观察  70-71
  4.3 ALV-J 感染鸡体内 ALV-J 负载量，CHNHE1 蛋白、C-MYC、P53 及 EAV-0、E51 表达量的测定  71-74
5 全文结论  74-75
参考文献  75-79
攻读硕士学位期间发表、录用（或已投稿）论文  79-80
致谢  80

蛋鸡禽白血病J亚群流行病学调查及致病性研究

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