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鸡马立克氏病发病过程中HSP60表达和mRNA转录的动态变化及其相关性研究

作　者: 李娟
导　师: 刘思当
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 热休克蛋白60 马立克氏病病理学变化定位表达量转录水平
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是组织细胞在应激因素刺激下所产生的一组高度保守的蛋白家族，它不仅在机体各种应激状态下会过量表达，在某些肿瘤组织中也会出现异常表达，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、耐药机制及与肿瘤相关的免疫反应,与肿瘤的发生、发展密切相关。而作为重要代表成员之一的HSP60，对其在肿瘤发病学中的表达和作用的研究则较少，尤其在禽肿瘤性疾病中的研究国内尚未见报道。基于以上背景，本研究取1日龄SPF雏鸡分为MDV-RB1B病毒接种组，HVT疫苗免疫组及无感染、无免疫空白对照组，3组均依次接种ND＋H9AI灭活和ND弱毒疫苗，成功建立鸡MD肿瘤模型。各组定期采外周血通过HA/HI方法测定血清中ND和H9AI的抗体滴度，反映MDV引起的免疫抑制情况，ELISA方法检测血清中HSP60抗体含量的动态变化；定期剖杀采集主要器官组织，制作石蜡切片，HE染色以观察组织病理学变化，免疫组织化学染色检测HSP60在各器官组织中的分布，ELISA检测组织内HSP60含量的动态变化，实时FQ RT-PCR技术定量检测组织内HSP60mRNA的转录水平。分析在肿瘤发病机体内HSP60在核酸及蛋白水平上的变化规律，探讨其变化与肿瘤发生、发展的相关性，为进一步研究HSP60在肿瘤发病学中的作用奠定基础，同时也为动物肿瘤病的诊断和新型治疗药物的研发提供新思路。实验结果表明，本试验成功建立了MD动物肿瘤模型，病毒株感染后，自21日龄起各内脏器官先后出现灰白色或黄白色肿瘤结节，病理组织学检查肿瘤组织为多形态淋巴样细胞；MDV感染迅速导致机体的持续性免疫抑制，攻毒组在21~42日龄检测血清中ND抗体滴度显著低于对照组（P<0.05），在14~42日龄检测H9AI的抗体滴度始终极显著低于对照组。攻毒组血清中HSP60的抗体水平始终高于两对照组，28~86日龄间差异达极显著水平（P<0.01)；HSP60在试验鸡体内各组织器官瘤细胞胞浆内均呈强阳性表达，在瘤灶外仅肝脏和肾脏组织细胞的胞浆中有少量阳性表达；在试验期内攻毒组各组织内HSP60的表达量、mRNA转录水平均始终高于两对照组，不同组织呈显著或极显著性差异，但HSP60的表达量与mRNA转录水平之间未呈一致的对应关系。本研究结果表明：MDV-RB1B病毒株感染可引起速发性内脏型MD肿瘤，会显著抑制ND和H9AI的免疫反应；在肿瘤发生发展过程中，血清内HSP60抗体水平升高，肿瘤病灶及周围组织内HSP60的表达量增加，HSP60mRNA转录水平也相应增加；HSP60表达量同其mRNA转录水平的变化趋势并非完全一致的线性关系，两者与肿瘤的发生、发展密切相关，两者的检测对鸡MD的诊断及发病进程的判定有重要的参考价值。

全文目录

符号说明  5-10
中文摘要  10-12
Abstract  12-14
1 引言  14-29
  1.1 热休克蛋白在肿瘤中的研究进展  14-15
  1.2 热休克蛋白 60（HSP60）的分布  15-16
  1.3 HSP60 的分子生物学特点  16-20
    1.3.1 HSP60 的基因特点  16
    1.3.2 HSP60 的转录调控  16-19
    1.3.3 HSP60 mRNA 的翻译表达  19-20
    1.3.4 HSP10  20
  1.4 HSP60 的生物学功能  20-23
    1.4.1 HSP60 的结构特点  20
    1.4.2 HSP60 的分子伴侣机制  20-21
    1.4.3 HSP60 与蛋白构象的形成及修复  21-22
    1.4.4 HSP60 与蛋白转运  22
    1.4.5 HSP60 与细胞应激  22-23
  1.5 HSP60 引起的免疫反应  23-24
  1.6 HSP60 与肿瘤  24-26
    1.6.1 HSP60 在肿瘤中的表达  24
    1.6.2 HSP60 与肿瘤细胞凋亡  24
    1.6.3 HSP60 与肿瘤治疗  24-26
    1.6.4 HSP60 与肿瘤免疫  26
  1.7 马立克氏病概况  26-27
  1.8 本课题研究的目的及意义  27-29
2 材料与方法  29-36
  2.1 材料  29-31
    2.1.1 主要试剂和仪器  29-30
    2.1.2 主要试剂的配制  30
    2.1.3 玻片的处理  30-31
    2.1.4 病毒  31
    2.1.5 疫苗  31
    2.1.6 实验动物  31
  2.2 方法  31-36
    2.2.1 鸡马立克氏病动物模型的建立  31-32
    2.2.3 MD 发病鸡肿瘤组织中 HSP60 定位检测  32-33
    2.2.4 MD 发病鸡组织中 HSP60 表达水平动态变化检测（ELISA）  33-34
    2.2.5 MD 发病鸡组织中 HSP60 mRNA 转录水平动态变化检测  34-36
    2.2.6 分析及统计  36
3 结果与分析  36-53
  3.1 MD 动物模型的建立  36-39
    3.1.1 MD 发病鸡剖检变化  36
    3.1.2 MD 发病组织的病理检查结果  36-38
    3.1.3 MD 对 ND 和 H9 流感体液免疫影响的检测结果  38-39
  3.2 MD 发病鸡血清中 HSP60 抗体动态检测结果  39
  3.3 MD 发病鸡肿瘤组织中 HSP60 的定位和分布情况  39-41
  3.4 MD 发病鸡组织中 HSP60 表达水平的动态变化结果  41-46
    3.4.1 标准曲线  41-42
    3.4.2 心脏中 HSP60 的表达  42
    3.4.3 肝脏中 HSP60 的表达  42-43
    3.4.4 脾脏中 HSP60 的表达  43-44
    3.4.5 肺脏中 HSP60 的表达  44-45
    3.4.6 肾脏中 HSP60 的表达  45-46
  3.5 MD 发病鸡组织细胞中 HSP mRNA 转录水平的动态变化结果  46-53
    3.5.1 标准曲线制作  46-47
    3.5.2 荧光定量标准曲线  47-48
    3.5.3 HSP60mRNA 转录水平的变化  48-53
4 讨论  53-57
  4.1 鸡马立克氏病肿瘤模型的成功建立  53-54
    4.1.1 MD 动物模型成功确定  53
    4.1.2 MD 的免疫抑制作用  53-54
  4.2 MD 发病鸡 HSP60 的高表达和组织定位  54-55
    4.2.1 MD 发病鸡 HSP60 的高表达  54
    4.2.2 MD 发病鸡 HSP60 的组织定位  54-55
  4.3 MD 发病鸡 HSP60mRNA 的高转录  55-57
    4.3.1 一步法 RT-PCR 实时荧光染料法  55
    4.3.2 MD 发病鸡 HSP60mRNA 的高转录  55-57
5 结论  57-58
参考文献  58-66
致谢  66-68
硕士期间发表论文  68

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