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猪肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立及应用

作　者: 靳蒙蒙
导　师: 雷治海
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪肺炎支原体重组质粒荧光定量PCR TaqMan探针
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引起猪气喘病(Mycoplasma pneumoniae of swine, MPS)的主要病原,也是猪呼吸道综合征(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC)的主要原发性病原之一。MPS是一种慢性的、传播性强的且在世界各地广泛分布的疾病,主要导致患猪生长缓慢、饲料转化率低并常常引起其他病原的继发感染,给养猪业造成巨大的损失。针对MPS的诊断方法,包括临床诊断、病理组织学诊断和实验室诊断方面的诊断方法,目前Mhp的诊断主要方法有分离培养法、免疫荧光法、核酸探针法以及聚合酶链式反应(Polym erase Chain Reaction, PCR)等,在当今规模化猪场中,猪感染后多呈慢性或隐性感染,这些方法虽然可以对病原做出诊断,但存在费时费力、代价高、敏感性和特异性不够理想等缺点。近年来,国内外开始利用荧光定量PCR技术检测猪肺炎支原体并对猪肺炎支原体进行精确定量的研究,但对以TaqMan荧光定量PCR定性定量检测Mhp的研究还比较少。目前研究较多的的猪肺炎支原体蛋白基因有P36、P46、P65、P97等,基于纤毛粘附因子P97是Mhp引起猪地方性肺炎的主要蛋白因子,本研究根据GenBank公布的Mhp P97基因序列,设计合成了特异性引物,PCR扩增Mhp168株的P97基因序列,克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T/P97,经测序鉴定为标准阳性质粒。根据阳性质粒的拷贝数,建立标准曲线,标准样品浓度的对数与Ct值之间的线性关系方程为Y(Ct)=-3.41X+42.549；在国内首先建立了以P97为靶基因序列的TaqMan荧光定量PCR检测方法。通过测定Mhp菌液拷贝数后,将Mhp DNA进行10倍比稀释,以此来检测TaqMan荧光定量PCR检测方法的敏感性,敏感性达8.3copy/μL;通过与其他菌株进行TaqMan荧光定量PCR扩增比较,Mhp与其它病原无交叉感染,特异性良好；稀释后以不同浓度的质粒进行荧光定量PCR扩增,重复性良好,此方法可用于猪肺炎支原体培养物和组织样品的快速定量检测。在此基础上,将TaqMan荧光定量PCR检测方法应用于临床实践中,通过定量检测灭活前后猪肺炎支原体疫苗中Mhp基因含量,发现Mhp含量无显著变化,说明灭活不影响疫苗中Mhp基因含量；通过检测猪肺炎支原体在攻毒猪体内各组织的分布,发现猪肺炎支原体在呼吸器官含量最多,约为106copy/μL,而在其他组织分布较少,如在小肠、肌肉、脑、肝、心等组织中含量约为102copy/μL甚至更少,在肾、淋巴结中则无；采取43份猪肺组织,比较荧光定量PCR检测法与套式PCR检测法检测效果,荧光定量PCR检出率100%,套式PCR检出率为79%,验证了本试验中所建立的荧光定量PCR检测方法敏感性高于套式PCR；通过检测猪场病变猪肺组织中Mhp含量变化,可了解整个猪场感染Mhp的情况。这些均验证了所建立的TaqMan荧光定量PCR检测猪肺炎支原体方法能较好地运用于临床试验中。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
第一章文献综述  13-24
  1 病原学特点  13-17
    1.1 细胞学特性  13-14
    1.2 生物学特性  14-17
      1.2.1 Mhp基因的研究  14-15
      1.2.2 蛋白抗原基因  15-17
        1.2.2.1 P36蛋白  15
        1.2.2.2 P46蛋白  15-16
        1.2.2.3 P65蛋白  16
        1.2.2.4 P97蛋白  16
        1.2.2.5 P110蛋白  16-17
  2 流行病学  17-18
  3 致病机理  18
  4 诊断学方法  18-22
    4.1 病原分离培养  18-19
    4.2 清学诊断方法  19
      4.2.1 免疫荧光技术  19
      4.2.2 间接血凝试验、补体结合试验、ELISA试验  19
    4.3 分子生物学诊断方法  19-22
      4.3.1 核酸探针  20
      4.3.2 PCR检测  20-22
  5 问题及展望  22-24
第二章猪肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立  24-44
  1 材料  24-26
    1.1 菌株及质粒载体  24-25
    1.2 主要试剂  25
    1.3 主要仪器  25
    1.4 主要溶液配方  25-26
  2 方法  26-33
    2.1 引物设计与合成  26
      2.1.1 常规PCR Mhp P97 F/R引物  26
      2.1.2 Real-time PCR Mhp P97 real F/R引物及探针  26
    2.2 猪肺炎支原体的培养  26
    2.3 Mhp模板的制备  26-27
    2.4 Mhp P97基因的PCR扩增  27-28
    2.5 目的基因的回收  28
    2.6 Mhp P97基因与pMD18-T载体连接  28-29
    2.7 连接产物的转化  29
    2.8 重组质粒DNA的提取、鉴定及测序  29-31
      2.8.1 质粒的提取  29-30
      2.8.2 PCR鉴定  30
      2.8.3 重组质粒的酶切鉴定  30
      2.8.4 重组质粒的测序鉴定  30-31
    2.9 荧光定量PCR检测方法的建立  31-33
      2.9.1 猪肺炎支原体模板的提取(水煮法)  31
      2.9.2 Taqman Real-Time PCR反应体系及反应条件  31
      2.9.3 含猪肺炎支原体P97质粒的拷贝数计算  31
      2.9.4 猪肺炎支原体P97定量PCR方法的建立  31-33
        2.9.4.1 标准曲线的建立  32
        2.9.4.2 敏感性试验  32
        2.9.4.3 特异性试验  32-33
          2.9.4.3.1 各菌株模板的提取  32-33
          2.9.4.3.2 反转录cDNA的合成  33
        2.9.4.4 重复性试验  33
  3 结果与分析  33-41
    3.1 猪肺炎支原体P97常规PCR退火温度的优化  33-34
    3.2 猪肺炎支原体P97片段扩增结果  34-35
    3.3 猪肺炎支原体P97片段回收结果  35
    3.4 重组质粒pMD18-T/P97的鉴定  35-37
      3.4.1 重组质粒pMD18-T/P97的PCR鉴定  35-36
      3.4.2 重组质粒pMD18-T/P97的酶切鉴定  36-37
    3.5 质粒测序结果  37
    3.6 标准曲线的建立  37-39
    3.7 敏感性的检测  39-40
    3.8 特异性检测  40
    3.9 重复性检测  40-41
  4 讨论  41-42
  5 小结  42-44
第三章猪肺炎支原体实时荧光定量PCR探针方法的应用  44-58
  1 材料  44-45
    1.1 菌种及组织材料  44-45
    1.2 主要试剂  45
    1.3 主要仪器设备  45
    1.4 试剂配方  45
  2 方法  45-49
    2.1 PCR反应中引物的设计及合成  45-46
      2.1.1 Real-time PCR Mhp P97 real F/R引物及探针  45
      2.1.2 套式PCR引物的设计与合成  45-46
    2.2 猪肺炎支原体的培养(同第二章2.2)  46
    2.3 含猪肺炎支原体P97片段的质粒的提取(同第二章2.8.1)  46
    2.4 猪肺炎支原体模板的提取  46-47
      2.4.1 猪肺炎支原体NJ株菌液模板的提取  46
      2.4.2 攻毒猪肺炎支原体的猪各部分组织DNA的提取  46
      2.4.3 攻毒Mhp的猪各部分组织DNA的提取(同第三章2.4.2)  46-47
      2.4.4 病变猪肺组织及样品组织DNA的提取(同第三章2.4.2)  47
    2.5 Taqman Real-Time PCR反应体系及反应条件  47
    2.6 套式PCR反应体系及反应条件  47-48
    2.7 TaqMan荧光定量PCR检测临床样品  48-49
      2.7.1 检测灭活对猪肺炎支原体的影响  48
      2.7.2 检测攻毒Mhp猪不同部位的Mhp含量变化  48
      2.7.3 比较荧光定量PCR与套式PCR检测猪肺组织的Mhp检出率  48-49
      2.7.4 检测江苏省某猪场中不同猪感染Mhp程度  49
  3 结果与分析  49-55
    3.1 检测灭活前后猪肺炎支原体菌液中Mhp含量变化  49-50
    3.2 猪肺炎支原体在攻毒猪不同组织中的分布  50-51
    3.3 比较荧光定量PCR与套式PCR检测猪肺组织的敏感性  51-53
    3.4 检测猪场病变猪肺组织中Mhp含量  53-55
  4 讨论  55-57
    4.1 检测灭活前后Mhp菌体中Mhp含量  55
    4.2 检测攻毒Mhp猪体内Mhp的分布  55-56
    4.3 比较荧光定量PCR与套式PCR检测的意义  56
    4.4 检测猪场中感染Mhp情况的意义  56-57
  5 小结  57-58
全文总结  58-59
参考文献  59-64
致谢  64

猪肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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