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TGEV S-AD蛋白亲和肽的筛选及鉴定
作 者: 王雪
导 师: 任晓峰
学 校: 东北农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: TGEV S-AD蛋白 噬菌体展示技术 ELISA诊断方法 抗病毒活性
分类号: S858.28
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要
猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的以严重的呕吐、脱水和腹泻为主要特征的猪的一种急性高度接触性肠道传染病,该病的流行给养猪业带来了巨大的损失。因此传染性胃肠炎病毒一直是猪病研究的热点之一。纤突蛋白(S)是TGEV表面突起的糖蛋白,可以刺激动物机体产生特异性的中和抗体并能使病毒与细胞膜上的特异性受体结合,参与细胞膜融合等过程,是作为免疫保护性抗原的主要候选基因。故S蛋白在猪传染性胃肠炎病毒诊断试剂及新型疫苗研究领域具有重要价值。本研究将包含S-AD (1102bp-1812bp)基因片段的重组质粒pET30a-S-AD在E.coli Rosetta中进行高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量为34KDa,与预期大小一致。Western-Blot显示,此蛋白可与TGEV的多抗血清发生特异性反应,说明该重组蛋白具有很好的反应原性。利用噬菌体展示技术,以S-AD重组蛋白为靶分子进行了四轮生物淘选。结果显示,经过四轮生物学筛选后,成功筛选出9种能与靶分子蛋白结合的十二肽。并应用筛选出的噬菌体,建立了一种针对TGEV的快速的,敏感性与特异性均很强且操作简单的噬菌体ELISA检测方法。将亲和力最高的序列合成多肽,命名为T多肽,序列为:-T-L-N-M-H-L-F-P-F-H-T-G-。使用TCID50、噬斑法和间接免疫荧光检测了T多肽的体外抗病毒活性。结果显示TGEV和T多肽37℃孵育1h后,加入ST细胞这种方式可有效的降低病毒的感染。本研究为建立新的TGE诊断方法和TGEV多肽疫苗的研发提供了一定的理论依据。
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全文目录
摘要 8-9 Abstract 9-10 1 前言 10-16 1.1 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)研究进展 10-13 1.1.1 传染性胃肠炎的历史背景 10 1.1.2 猪传染性胃肠炎病毒的形态特征培养特性及理化特性 10-11 1.1.3 猪传染性胃肠炎病毒的基因组结构及编码蛋白 11 1.1.4 TGEV的S基因及其编码S蛋白的研究概况 11 1.1.5 TGEV的诊断方法 11-13 1.2 噬菌体展示技术研究进展 13-15 1.2.1 噬菌体展示技术的基本原理 13-14 1.2.2 噬菌体展示技术的应用 14-15 1.3 研究的目的与意义 15-16 2 材料与方法 16-32 2.1 实验材料 16-18 2.1.1 菌种、载体、质粒、细胞株及毒株 16 2.1.2 工具酶、试剂盒、抗体等 16 2.1.3 实验所需各种缓冲液和培养基的配制 16-17 2.1.4 主要药品及试剂 17 2.1.5 仪器设备 17-18 2.2 实验方法 18-32 2.2.1 重组质粒的鉴定 18-20 2.2.2 重组质粒pET30a-S-AD的诱导表达 20-21 2.2.3 重组蛋白的纯化及复性 21-22 2.2.4 噬菌体随机十二肽库对靶分子的生物淘选 22-23 2.2.5 结合克隆的特征鉴定 23-25 2.2.6 TGEV噬菌体ELISA检测方法建立及检测效果评价 25-28 2.2.7 所选多肽配体氨基酸序列的推导 28-29 2.2.8 合成多肽的抗病毒活性鉴定 29-32 3 结果 32-46 3.1 重组质粒的鉴定 32-34 3.1.1 重组质粒的PCR鉴定 32-33 3.1.2 重组质粒的双酶切鉴定 33-34 3.2 重组蛋白的表达及活性鉴定 34-36 3.2.1 重组蛋白的表达 34-35 3.2.2 Western-Blot检测重组蛋白 35-36 3.3 重组蛋白的纯化及复性 36-37 3.4 噬菌体十二肽库对重组S-AD蛋白的生物淘选 37-40 3.4.1 淘选产物的滴度测定结果 37-38 3.4.2 噬菌体结合克隆的ELISA初步鉴定结果 38 3.4.3 噬菌体结合克隆模板DNA的纯化结果 38-39 3.4.4 噬菌体结合克隆的测序及编码氨基酸序列推导 39-40 3.5 噬菌体ELISA建立及检测效果评价 40-43 3.5.1 噬菌体ELISA与普通多抗ELISA及RT-PCR的敏感性比较 40-42 3.5.2 噬菌体ELISA的特异性实验 42-43 3.6 多肽的抗病毒活性检测 43-46 3.6.1 病毒滴度法检测多肽的抗病毒活性 43-44 3.6.2 噬斑法检测多肽的抗病毒活性 44-45 3.6.3 免疫荧光法检测多肽的抗病毒活性 45-46 4 讨论 46-50 4.1 靶蛋白的选择 46-47 4.2 以S-AD蛋白为靶分子的噬菌体筛选 47-48 4.3 结合克隆的选择 48 4.4 TGEV噬菌体ELISA检测方法 48-49 4.5 S-AD蛋白亲和肽的鉴定与功能分析 49-50 5 结论 50-51 致谢 51-52 参考文献 52-56 攻读硕士期间发表的学术论文 56
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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