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体细胞核移植制备转IGF-1基因奶山羊的研究

作　者: 林建
导　师: 杨倩
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 类胰岛素生长因子(IGF-1) 双亲性小分子 核定位信号肽 体细胞核移植 转IGF-1基因奶山羊 TAIL-PCR鉴定
分类号: S827
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目前我国的奶山羊品种与发达国家相比差距明显,缺乏国际竞争力,突出表现为产量奶低,多数羊的年产奶量不足300kg,经济效益不高。为解决这一问题,本研究通过转基因技术培育高产奶量的奶山羊。本试验选取在乳腺发育和泌乳中起着重要作用的类胰岛素生长因子(IGF-1)基因作为转入的目的基因。通过分子生物学的方法,构建了乳腺特异性表达类胰岛素生长因子的载体pIN；然后分别转染人乳腺癌细胞系(Bcap-37)和山羊乳腺上皮细胞(GMEC)以验证乳腺特异性表达载体pIN表达IGF-1的能力,进一步的研究将载体pIN灌注泌乳期山羊乳腺以验证其生物学功能。在确认了载体pIN可以表达IGF-1后,我们使用脂质体法将载体pIN转染山羊胎儿成纤维细胞和小羊耳皮成纤维细胞,通过抗性筛选和单克隆挑选获得转IGF-1基因阳性克隆细胞。将获得的转IGF-1基因阳性克隆细胞通过体细胞核移植技术移植到去核的卵母细胞中,融合激活后待其发育到囊胚期,移植至代孕母羊,最后获得4只克隆奶山羊。提取克隆奶山羊的血液基因组,通过荧光定量PCR、Southern-blot以及TAIL-PCR等方法一方面鉴定本研究获得的克隆羊为转IGF-1基因奶山羊,另一方面检测转IGF-1基因奶山羊中外源IGF-1基因插入的拷贝数以及部分插入位点的侧翼序列。总的来说,转IGF-1基因奶山羊的培育,为通过转基因技术提高山羊奶产量奠定了基础。本研究中主要试验内容分为以下五部分：1.山羊乳腺特异性表达载体的构建及其验证本研究的目的是构建山羊乳腺特异性表达载体pIN,并在体内体外检验载体pIN的生物学活性,为下一步生产高产奶量转基因奶山羊奠定基础。第一步,以萨能奶山羊为材料,采用RT-PCR的方法从奶山羊的肝脏组织中扩增465bp的类胰岛素生长因子1(insulin-like growth factors-1,igf-1)基因；同时以真核表达载体pCDNA3.1为模板,扩增1505bp的真核筛选标记neo基因。第二步,以乳腺特异性表达载体pBC1为骨架载体,先将扩增的igf-1基因插入p-酪蛋白5’端启动子的下游,再将克隆的neo基因克隆到β-酪蛋白3’端终止子的下游,构建乳腺特异性表达载体pIN。第三步,采用脂质体法将构建好的乳腺特异性表达载体pIN转染人乳腺癌细胞系(Bcap-37)和山羊乳腺上皮细胞,同时使用乳腺灌注法将载体pIN导入泌乳期山羊乳腺组织中去检测乳腺特异性表达载体pIN的生物学功能。体外试验结果显示：在Bcap-37细胞中,载体pIN转染组的IGF-1蛋白和mRNA表达量均显著高于对照组(p<0.05)；在山羊乳腺上皮细胞中,转染载体pIN的细胞可以成功诱导表达IGF-1。体内试验结果进一步证实本研究所构建的乳腺特异性表达载体pN可以在山羊乳腺组织中成功表达IGF-1,为增加羊奶产量奠定基础。2.双亲性小分子DMSO和薄荷醇增加转染效率的研究简单、快速和高效地将目的基因转入细胞核将会有利于加速转基因阳性细胞的筛选过程。转染增强剂的使用可以有效的促进外源基因的转运。在众多增强剂中,双亲性小分子化合物二甲基亚枫(DMSO)和薄荷醇可以有效的提高基因的转染效率。本研究首先使用MTT法检测DMSO和薄荷醇的细胞毒性,摸索出对细胞没有伤害或者伤害很小的最适使用浓度；接着在人乳腺癌细胞系(Bcap-37)上,使用荧光定量PCR和流式细胞检测法去评价DMSO和薄荷醇对转染效率的影响。研究结果表明2%(V/V)的DMSO和12.5μM薄荷醇可以显著提高外源基因的转染效率。荧光定量PCR结果显示,在薄荷醇后处理和DMSO前处理的Bcap-37细胞上,生长激素(GH)的mRNA表达量提高了10倍以上；而在DMSO后处理和薄荷醇前处理的Bcap-37细胞上,GH的mRNA表达量则提高了30倍以上。荧光显微镜观察结果和流式细胞检测结果进一步证明DMSO和薄荷醇处理细胞可以增加表达绿色荧光的细胞数量。与单独脂质体转染组相比较,DMSO后处理组和薄荷醇前处理组表达绿色荧光的细胞比例增加了15%。进一步细胞周期分析发现,DMSO和薄荷醇处理均可以显著影响细胞周期,大大的改变了细胞周期停滞的比例。这一结果表明DMSO和薄荷醇可能是通过影响细胞周期来增加转染效率的。总的来说,DMSO和薄荷醇处理细胞均可以显著增加转染效率,其中DMSO后处理细胞的方式可以更有效的增加转染效率3.核定位信号肽增加转染效率的研究转基因阳性细胞筛选效率低下的问题严重限制转基因动物的发展；其中外源DNA片段(尤其是大分子DNA片段)转运进入细胞核是转基因阳性细胞筛选中最重要的限速步骤。研究发现核定位信号(NLS)可以协助大分子亲核蛋白的入核转运；补骨脂素(SPB)可以非共价结合DNA片段以保护其在转运过程中不被核酸酶降解。因此,本研究人工合成经典的核定为信号肽"CGGPKKKRKVP (NLS)"以及核定为信号肽-补骨脂素复合物"SPB-PKKKRKV(SPB-NLS)"去协助大分子DNA片段的转运,希望能够增加转染效率,继而可以应用到转基因阳性细胞的筛选中去。本研究通过荧光定量PCR,激光共聚焦观察以及流式细胞检测等技术对NLS及SPB-NLS的生物学功能进行检测。荧光定量PCR结果显示：在NLS和SPB-NLS介导的转染中,生长激素(GH)的mRNA表达量分别增加了69%和330%。流式细胞检测发现绿色荧光阳性细胞的数量在SPB-NLS组中增加了32.4%；然而在NLS组中,其阳性细胞的数量却减少了75%。进一步试验(western-blot)证实SPB-NLS介导的转染可以显著的增加转染基因的表达效率(在人乳腺癌细胞的研究中,SPB-NLS介导的转染增加了GFP的表达量；在山羊乳腺上皮细胞的研究中,SPB-NLS介导的转染增加了IGF-1的表达量)。最后,本研究通过激光共聚焦显微镜观察发现SPB-NLS介导的转染可以增加外源基因如何的效率。总的来说,本研究证实SPB-NLS是一种优良的转染增强剂,很有希望被广泛用于外源基因的转染以及转基因阳性细胞的筛选。4.转IGF-1基因阳性克隆细胞的筛选及转IGF-1基因奶山羊的制备转基因动物的制备一直以来就是人们关注的焦点和难点,尤其是转基因大型家畜的制备。本研究首先分离培养奶山羊胎儿成纤维细胞和小羊耳皮成纤维细胞,摸索不同浓度的G418对两种细胞的毒性,选取2周内能将细胞全部杀死的临界浓度作为抗性筛选浓度(800ng/mL G418:胎儿成纤维细胞,600ng/mL G418:小羊耳皮成纤维细胞)。然后通过电转染法将乳腺特异性表达载体pIN转染到小羊耳皮成纤维细胞和胎儿成纤维细胞中去。转染48小时后,更换培养基并添加G418进行抗性筛选,筛选10天左右出现明显的单克隆细胞团。此时将G418的浓度降至维持浓度(300ng/mL),维持3-5天后,挑取单克隆细胞至48孔细胞培养板。待单克隆细胞扩大培养至6孔板后,将一部分单克隆细胞提取基因组DNA进行PCR验证,另一部分单克隆细胞冻存后用于核移植试验。本试验共筛选到46个单克隆细胞株,挑选其中生长状态良好的12个单克隆细胞进行PCR鉴定；PCR鉴定结果显示igf-1和neo基因整合进入细胞基因组的阳性克隆有2个。挑选验证阳性的单克隆细胞进行体细胞核移植制备转IGF-1基因奶山羊。本试验共获得4只转IGF-1基因奶山羊。5.转IGF-1基因奶山羊的鉴定转基因动物基因组中不但含有特定的外源基因序列,还包括特定的启动子、调控元件和标记基因等,这些是进行转基因鉴定的基础。在鉴定转基因动物时,除了检测外源基因的存在、表达与否外,还需要对转入基因的完整性、整合位点以及拷贝数等情况进行分析。本研究首先通过普通PCR和Southern-blot鉴定所获得的克隆羊为转IGF-1基因奶山羊；然后通过绝对荧光定量PCR和热不均一交错PCR(TAIL-PCR)进一步检测体细胞核移植技术生产的转IGF-1基因奶山羊中插入的外源基因拷贝数和整合位点。普通PCR检测结果表明转IGF-1基因奶山羊基因组中整合有igf-1基因和neo基因；Southern-blot结果进一步证实所获得的克隆羊为转IGF-1基因奶山羊。绝对荧光定量可以精确的分析外源基因在基因组中的拷贝数,本研究首先制备标准曲线(log2N(拷贝数)=-1.0244△Ct+5.3576(R2=0.9963)),接着检测转IGF-1基因奶山羊中外源IGF-1基因的拷贝数,结果显示4只转IGF-1基因奶山羊中外源基因拷贝数均为8个拷贝；进一步TAIL-PCR成功鉴定了转IGF-1基因奶山羊中外源基因的部分整合位点。3轮特异性的TAIL-PCR得到的多条特异性条带,经测序和BLAST比对得到4个特异性位点,这四个位点分别位于牛基因组的2,11,16和18四条染色体中。本研究初步建立了绝对荧光定量PCR和TAIL-PCR检测外源基因拷贝数和整合位点侧翼序列分析的体系,为今后研究外源基因在转基因奶山羊的中遗传和表达奠定了基础。

全文目录


摘要  10-14
ABSTRACT  14-19
引言  19-21
第一篇 文献综述  21-65
  第一章 转基因动物研发现状的研究进展  21-45
    1 传统转基因技术  22-23
      1.1 显微注射法  22
      1.2 精子载体法  22
      1.3 逆转录病毒感染法  22
      1.4 胚胎干细胞介导法  22-23
    2 现代的转基因技术  23-34
      2.1 体细胞核移植技术  23-24
      2.2 基因打靶技术  24-28
      2.3 RNA干扰介导的基因沉默技术  28-29
      2.4 慢病毒载体技术  29-30
      2.5 诱导多能干细胞转基因技术  30-32
      2.6 多基因转基因表达策略和分时段的调控表达策略  32-34
    3 乳腺的进化、发育及泌乳调节  34-41
      3.1 乳腺发育及泌乳  34-35
      3.2 激素和细胞因子对乳腺发育的影响  35-37
      3.3 影响乳腺的进化和泌乳的基因  37-38
      3.4 影响乳腺表达的其它因素  38-41
    4 IGF-1的功能及其与泌乳的关系  41-45
      4.1 IGF-I基因的结构及定位  41
      4.2 IGF-1的生物活性  41-42
      4.3 IGF-1与乳腺发育以及泌乳之间的关系  42-45
  第二章 提高转基因阳性细胞筛选效率的几种策略  45-56
    1 转基因研究的瓶颈  45-47
      1.1 转基因供体阳性细胞筛选效率过低,转基因总体效率低下  45
      1.2 外源基因表达不稳定,表达水平低下  45-46
      1.3 插入的基因的位置难以控制  46-47
    2 外源DNA克服屏障进入细胞的机制  47-49
      2.1 细胞内吞机制  47-48
      2.2 溶酶体逃避的机制  48
      2.3 胞质内的运输  48-49
      2.4 外源DNA进入细胞核的途径  49
    3 核定位信号肽促进DNA入核,增加转染效率  49-53
      3.1 核定位信号的分类  50-51
      3.2 核定位信号介导的入核机制  51
      3.3 核输入的结构基础及调控  51-52
      3.4 核定位信号肽及其复合物的应用  52-53
    4 双亲性小分子作用细胞增加转染效率  53-56
      4.1 双亲性小分子与核孔复合体之间的相互作用  53-54
      4.2 双亲性小分子增加转染效率的研究  54-56
  参考文献  56-65
第二篇 试验研究  65-153
  第三章 山羊乳腺特异性表达载体PIN的构建及其功能验证  65-83
    摘要  65-66
    前言  66
    1 材料和方法  66-72
      1.1 材料和仪器  66-69
      1.2 类胰岛素生长因子(IGF-1)基因的克隆  69
      1.3 标记基因新霉素(neo)的克隆  69
      1.4 乳腺特异性表达载体pIN的构建与验证  69-70
      1.5 乳腺特异性表达载体pIN的生物学功功能验证  70-72
      1.6 数据分析  72
    2 试验结果  72-77
      2.1 igf-1基因和neo基因的克隆与分析  72-73
      2.2 乳腺特异性表达载体pIN的鉴定  73
      2.3 乳腺特异性表达载体pIN的生物学功功能验证  73-77
    3 讨论  77-80
    参考文献  80-83
  第四章 双亲性小分子DMSO和薄荷醇增加转染效率的研究  83-99
    摘要  83-84
    前言  84
    1 材料和方法  84-88
      1.1 材料和仪器  84-86
      1.2 MTT细胞毒性试验确定DMSO和薄荷醇使用浓度  86-87
      1.3 荧光定量PCR检测DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响  87
      1.4 荧光显微镜观察DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响  87
      1.5 流式细胞检测DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响  87-88
      1.6 流式细胞检测DMSO和薄荷醇作用对细胞周期的影响  88
      1.7 数据分析  88
    2 试验结果  88-94
      2.1 MTT法检测不同浓度DMSO和薄荷醇对细胞的细胞毒性作用  88-89
      2.2 荧光定量PCR检测转染效率  89-90
      2.3 荧光显微镜观察转染情况  90-92
      2.4 流式细胞检测转染效率  92
      2.5 流式细胞检测DMSO和薄荷醇作用对细胞周期的影响  92-94
    3 讨论  94-96
    参考文献  96-99
  第五章 核定位信号肽增加转染效率的研究  99-117
    摘要  99-100
    前言  100
    1 材料和方法  100-105
      1.1 材料和仪器  100-102
      1.2 NLS/DNA和SPB-NLS/DNA复合物的制备  102
      1.3 琼脂糖凝胶阻滞试验  102-103
      1.4 NLS和SPB-NLS对转染效率的影响  103-104
      1.5 流式细胞分析NLS和SPB-NLS对细胞周期的影响  104
      1.6 激光共聚焦观察NLS和SPB-NLS协助质粒DNA入核情况  104
      1.7 Western-blot检测SPB-NLS介导的质粒在山羊乳腺上皮细胞上的表达情况  104-105
      1.8 数据分析  105
    2 试验结果  105-113
      2.1 琼脂糖凝胶阻滞试验确定最佳DNA与NLS/SPB-NLS的复合浓度  105-107
      2.2 NLS和SPB-NLS对转染效率的影响  107-109
      2.3 流式检测NLS和SPB-NLS介导的转染对细胞周期的影响  109-110
      2.4 激光共聚焦观察质粒DNA的入核情况  110-112
      2.5 Western-blot检测SPB-NLS介导的质粒在山羊乳腺上皮细胞上的表达情况  112-113
    3 讨论  113-115
    参考文献  115-117
  第六章 转IGF-1基因阳性克隆细胞的筛选及转IGF-1基因奶山羊的制备  117-131
    摘要  117-118
    前言  118
    1 材料和方法  118-122
      1.1 材料和仪器  118-120
      1.2 小羊耳皮成纤维细胞的分离和G418梯度抗性试验  120
      1.3 乳腺特异性表达载体pIN转染成纤维细胞与细胞筛选  120-121
      1.4 单克隆阳性细胞的PCR验证  121-122
      1.5 核移植转IGF-1基因奶山羊的制备  122
      1.6 数据分析  122
    2 试验结果  122-125
      2.1 奶山羊胎儿成纤维细胞和小羊耳皮成纤维细胞G418梯度抗性试验  122-123
      2.2 乳腺特异性表达载体pIn转染成纤细胞及细胞筛选  123
      2.3 单克隆阳性细胞的PCR验证  123-124
      2.4 转pIN基因奶山羊的制备情况  124-125
    3 讨论  125-127
    参考文献  127-131
  第七章 转IGF-1基因奶山羊的鉴定  131-153
    摘要  131-132
    前言  132-133
    1 材料和方法  133-140
      1.1 材料和仪器  133-134
      1.2 PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊  134-135
      1.3 Southern-blot鉴定转IGF-1基因奶山羊  135-136
      1.4 荧光定量PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊插入基因拷贝数  136-137
      1.5 TAIL-PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊插入位点序列  137-140
    2 试验结果  140-149
      2.1 PCR鉴定克隆奶山羊为转IGF-1基因奶山羊  140-142
      2.2 Southern-blot进一步确定克隆奶山羊为转IGF-1基因奶山羊  142-143
      2.3 荧光定量PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊质粒插入拷贝数  143-146
      2.4 TAIL-PCR鉴定转转IGF-1基因奶山羊外源基因插入位点序列  146-149
    3 讨论  149-151
    参考文献  151-153
全文结论  153-155
本文创新点  155-157
论文发表情况  157-159
致谢  159-160

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