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油茶几个关键PcG基因的克隆及其表达分析

作　者: 邬萌萌
导　师: 胡孝义
学　校: 安徽农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 油茶 PcG基因组织培养 cDNA克隆 RNAi
分类号: S794.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

油茶是我国南方重要的木本油料树种。它与油橄榄、油棕和椰子并称为“世界四大木本食用油料树种”。种子是油茶油脂来源的主要渠道，但并非唯一的。本研究利用体细胞胚的发育能够诱导油脂生物合成相关基因的表达的原理出发，拟通过对胚性基因有抑制作用的PcG基因的RNA沉默来达到提高油茶愈伤组织含油率的目的。为此，本研究首先对油茶愈伤组织的培养和愈伤组织材料的来源，如芽增殖体系等方面进行了优化。然后以茶树的同源基因为模板，克隆出了油茶几个关键的PcG基因的3`端序列。进而以所得序列信息为基础，设计了双链RNA发卡结构转化农杆菌LBA4404，并以油茶PDS发夹结构的LBA4404转化子的工程菌进行了叶片侵染，为进行PcG基因的RNA干扰实验奠定了基础。共获得了如下研究成果：1.油茶优良无性系叶片的组织培养研究。通过研究得出：1.0mg/LAgNO3、1000mg/L水解络蛋白、100mg/L谷氨酸、0.1mM腐胺等能够快速、高效的诱导出愈伤组织；1/2MS+2%蔗糖+0.7%琼脂+0.5mg/L TDZ+1.0mg/L IBA+1.0mg/L6-BA+1.0mM GSSG/0.1mM亚精胺的培养基配方可以分化出丛生芽；1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA为芽增殖的最优组合配方。2.克隆油茶PcG基因PRC1与PRC2两复合物各组分亚基CLF、PKL、EMF2基因的3`端片段。其中，获得了油茶EMF2基因的全长cDNA，命名为CoEMF2。该基因阅读框为1866bp，编码621个氨基酸。其蛋白分子量为70.54kD，是不稳定的疏水性蛋白；卷曲螺旋预测结果表明，CoEMF2蛋白中可能存在8个较为明显的螺旋结构；亚细胞定位表明CoEMF2位于细胞核中；还发现CoEMF2中含有两个保守区：VEFS-Box结构域和C2H2型锌指蛋白。3.油茶PcG基因的RNA干扰研究。利用Gateway技术，以pJawohl8-RNAi载体分别构建了油茶CLF、PKL、EMF2以及模式基因PDS的RNA干扰载体；以冻融法导入进农杆菌LBA4404中，通过测序和特异引物的PCR验证了这些重组载体和转化子的正确性。4.通过对油茶嫩叶的侵染，初步证明油茶转基因研究是可行的。选择适当的天气，以含有PDS发夹结构的LBA4404侵染油茶带有部分伤口的嫩梢/叶，出现了PDS被沉默后特有的漂泊症状。5.对几个关键PcG基因在不同组织中的定量PCR进行分析，发现愈伤组织中胚性基因的抑制性染色质标记H3K27me3的标记（CLF）和维持（LHP1）基因都维持在较低水平，但PKL的水平依然较高，因此今后攻克油茶体细胞胚的技术关键可能是PKL的生理效应的抑制方面。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 引言  9-21
  1.1 油茶的食用、营养保健价值及在国家粮油安全战略中的重要地位  9-10
  1.2 植物 PCG 的类别及在发育生物学上的功能  10-16
    1.2.1 植物 PcG 基因  10-13
    1.2.2 H3K27me3 的维持与去除  13-16
  1.3 RNAI技术的原理及应用  16-18
    1.3.1 RNAi 的原理与特点  16-17
    1.3.2 RNAi 的作用机制  17
    1.3.3 RNAi 在植物中的应用研究  17-18
  1.4 油茶高频再生体系是限制油茶分子生物学研究的瓶颈  18-19
  1.5 本研究的目的、意义与技术路线  19-21
2 油茶叶片体细胞胚诱导的优化尝试  21-28
  2.1 材料  21
  2.2 方法  21-23
    2.2.1 外植体消毒  21
    2.2.2 愈伤组织快速诱导研究  21-22
    2.2.3 愈伤组织分化诱导研究  22
    2.2.4 分化芽的增殖培养研究  22-23
  2.3 结果与分析  23-27
    2.3.1 愈伤组织快速诱导研究  23-24
    2.3.2 愈伤组织分化诱导研究  24
    2.3.3 分化芽的增殖培养研究  24-27
  2.4 小结与讨论  27-28
3 油茶 PCG 基因的克隆  28-54
  3.1 材料  28-29
    3.1.1 植物材料  28
    3.1.2 菌株和质粒  28
    3.1.3 酶及试剂  28-29
    3.1.4 仪器设备  29
  3.2 方法  29-38
    3.2.1 油茶嫩叶总 RNA 的提取  29-30
    3.2.2 3`RACE 引物设计及 3`RACE  30-34
    3.2.3 5`RACE 引物设计及 5`RACE  34-36
    3.2.4 目的片段回收  36
    3.2.5 大肠杆菌转化  36-37
    3.2.6 质粒 DNA 提取  37-38
    3.2.7 测序及生物信息学分析  38
  3.3 结果与分析  38-52
    3.3.1 油茶嫩叶片总 RNA 的提取  38
    3.3.2 电泳检测结果  38-41
    3.3.3 测序结果分析  41-46
    3.3.4 油茶 EMF2 基因的全长 cDNA 克隆及生物信息学分析  46-52
  3.4 小结与讨论  52-54
4 PCG 基因的 RNAI 载体构建及农杆菌转化  54-62
  4.1 材料  54-55
    4.1.1 菌株和质粒  54-55
    4.1.2 酶、抗生素及试剂  55
    4.1.3 仪器设备  55
  4.2 方法  55-59
    4.2.1 干扰片段引物设计  55-56
    4.2.2 PCR 扩增含 attB 接头序列的目的片段  56
    4.2.3 BP 重组反应  56-57
    4.2.4 LR 重组反应  57-58
    4.2.5 LBA4404 农杆菌感受态细胞的制备  58
    4.2.6 LR 重组质粒冻融法转化 LBA4404  58-59
  4.3 结果与分析  59-61
    4.3.1 加 attB 接头的片段电泳检测  59-60
    4.3.2 BP 重组反应电泳检测  60
    4.3.3 LR 重组反应电泳检测  60-61
    4.3.4 农杆菌转化的鉴定  61
  4.4 小结与讨论  61-62
5 农杆菌介导的油茶叶片快速侵染的可行性  62-67
  5.1 材料  62-63
    5.1.1 植物材料  62
    5.1.2 基因材料、发夹结构构建及农杆菌转化  62-63
  5.2 方法  63-64
    5.2.1 侵染用工程菌的制备  63
    5.2.2 油茶对 Basta 的耐受性试验  63
    5.2.3 农杆菌田间侵染及共培养  63-64
    5.2.4 RNAi 效应的检测  64
  5.3 结果调查与分析  64-66
    5.3.1 油茶可一定程度耐受 Basta 药害  64-65
    5.3.2 油茶嫩叶快速侵染可能导致 RNAi 效应  65-66
  5.4 小结与讨论  66-67
6 几个关键 PCG 基因在不同器官中的表达分析  67-71
  6.1 材料  67
    6.1.1 植物材料  67
    6.1.2 酶及试剂、仪器设备  67
  6.2 方法  67-68
    6.2.1 RNA 的制备  67
    6.2.2 实时荧光定量 PCR  67-68
  6.3 结果与分析  68-70
  6.4 小结与讨论  70-71
7 总结  71-72
  7.1 本研究的主要结论  71
  7.2 展望与建议  71-72
参考文献  72-81
致谢  81-82
作者简介  82
在读研究生期间发表的文章  82

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