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胡杨基因组DNA大片段的拟南芥转化及突变体初步鉴定

作　者: 朱晓静
导　师: 杨敏生
学　校: 河北农业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: BIBAC文库拟南芥花粉管通道法转基因叶色突变体
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

土壤沙漠化和盐渍化是一个世界性的问题，研究天然耐盐抗旱植物的分子机理，筛选出有育种潜力的抗性基因或调控元件，培育新型的耐盐作物品系是解决这一状况最有效的途径，也是一直以来科学研究的热点之一。胡杨是我国西北和中亚荒漠、半荒漠地区风沙前沿唯一天然分布的乔木树种，在长期进化过程中形成了独有的优良基因和精密的表达调控机制，是十分珍贵的木本植物抗逆种质资源。因此，本研究以胡杨为研究对象，构建了胡杨基因组DNA大片段的BIBAC文库，转入模式植物拟南芥中获得转基因株系，筛选出表型变异株系并初步鉴定，进一步研究其变异产生的原因。主要研究结果如下：1.构建胡杨基因组DNA大片段BIBAC文库，转入农杆菌中。利用农杆菌介导的花粉管通道法对拟南芥进行侵染转化，探讨了表面活性剂Silwet L-77浓度、侵染液浸花时间、农杆菌与拟南芥花序共培养时间、抗性筛选Kan的浓度等因素对转化效率的影响，确定了Silwet L-77浓度0.2‰、浸花时间1min、黑暗处理共培养时间8h~10h，在含50mg·L-1Kan的AT培养基上进行转基因植株筛选的转化体系，经PCR检测，获得205个可育阳性转基因株系，并得到肉眼可辨的表型变异株系10个。选择一个黄化突变体株系y1-1进行初步鉴定，内容包括：2.对突变体y1-1的表型进行观察，确定该突变体株系为全株黄色并在整个生长发育期间保持稳定不变，能够光合生长和结实，T2代出现性状分离比3:1。3.对突变体y1-1的光合色素含量、净光合速率、叶绿素荧光等指标进行测定，以拟南芥野生型WT为对照，发现二者的色素种类基本一致，但突变体y1-1的总叶绿素含量是野生型WT的49.9%，造成其叶色偏黄。在低光强、高CO2浓度的生长条件下，前者的净光合速率是后者的2.47倍，表现出对环境较强的适应性。经过暗适应20min后光照1sec，前者的O-J-I-P曲线始终低于后者。JIP测定发现突变体y1-1的SM、MO分别是野生型WT的47.9%和80.2%，有效光反应中心数量RC/CSO是后者的74.6%，表明其PSⅡ发育不全；但突变体y1-1的光化学反应效率较高，ψO和φEo升高，单位光反应中心捕获和用于电子传递的能量占吸收总能量的比例（85.0%和52.9%）均高于后者（81.2%和50.6%）。4.对二者的叶绿体超微结构进行观察，发现与野生型WT相比，突变体y1-1叶绿体个体瘦长呈梭型，基质均一，内部结构排列疏松，淀粉粒较大，嗜锇颗粒较多，没有观察到发育成熟的基粒，基质片层呈近乎平行的状态遍布叶绿体腔。5.提取突变体y1-1的T2代植株叶片总DNA，利用TAIL-PCR技术获得外源DNA片段侧翼序列，与拟南芥基因组数据库（TAIR）比对，结果显示外源DNA片段位于拟南芥第5条染色体上6739.7kb~6740.9kb之间、基因AT5G19940的开放阅读框内。目前对基因AT5G19940的研究报道很少，对它编码的PAP蛋白的二级、三级结构进行同源建模，认为该蛋白位于叶绿体类囊体膜上，可能参与维持叶绿体脂类颗粒的结构完整性，与叶绿体结构相关大分子的活性有关，它的缺失有可能导致突变体y1-1基粒垛叠失败、叶绿体发育异常。6.对外源DNA的两端进行测序，发现外源DNA片段中包含半胱氨酸脱硫酶和甲酸脱氢酶的同源序列。

胡杨基因组DNA大片段的拟南芥转化及突变体初步鉴定

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