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毛白杨PtAUX1和PtPIN1基因的克隆及遗传转化

作 者: 闫辉
导 师: 樊金会
学 校: 山东农业大学
专 业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 毛白杨 生长素 极性运输 PtAUX1 PtPIN1
分类号: S792.117
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 5次
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内容摘要


杨树生长迅速,轮伐周期短,是典型的速生树种,在我国范围内广泛栽植,而且其遗传资源丰富,成为木本植物分子遗传研究的模式植物。杨树还是继拟南芥及水稻之后的第三个全序列测定的多年生木本植物。这意味着可以对杨树进行更为深层次的分子遗传学研究。五大类植物激素中,生长素是最早被发现的。在植物体中,生长素诱导离体茎和胚芽鞘切断的迅速伸长也是最快、最显著的激素反应。生长素同时参与了植物的多种生长发育过程。比如促进根、茎、叶的生长,影响胚胎发育,控制顶端优势、参与维管的形成等。本研究通过构建PtAUX1和PtPIN1基因的过量表达载体,利用农杆菌介导的方法转化毛白杨和拟南芥,获得了35S:: PtAUX1和35S:: PtPIN1转基因植株。通过对转基因植株的表型分析,为研究PtAUX1和PtPIN1基因功能提供了证据,并为深入研究基因的分子机制奠定了基础。研究结果如下:1.蛋白同源性分析,PtAUX1与毛果杨PttLAX1的同源性高达97.3%,与拟南芥AtAUX1的同源性高达83%;PtPIN1与苜蓿MtPIN1的同源性达82%,与拟南芥AtPIN7的同源性达79%。系统进化树分析,PtAUX1与AUX1家族的AtAUX1和PttLAX1极其相似。所以,PtAUX1是拟南芥AtAUX1的同源基因;PtPIN1是生长素输出载体PIN类家族中的一员。2.PtAUX1转毛白杨植株表型有,叶片数量明显增多,再生芽体周围出现子房状结构,成簇集生呈花序状,叶片上发生体状胚,将体状胚接种到MS培养基上,能够发育成完整植株。PtAUX1转拟南芥植株的表型有,不改变根的向地性,诱导侧根发生和根的伸长。表皮毛数目增多,多呈二叉分支。叶片边缘上翘并卷曲,呈现壳斗状。花瓣不张开而且透明,花萼卷曲伴有透明状,雄蕊改变了四强雄蕊的特性,有的雄蕊无花丝,花药粘连雌蕊出现透明和部分增生。通过PtAUX1基因转化毛白杨和拟南芥植株的表型,我们得知,PtAUX1基因参与了植株侧根发生以及根的伸长、参与了植物体的叶片、芽体、花器官、子房以及体状胚的发育过程。这一切得以实现的基础是PtAUX1基因作为生长素输入载体,调控着生长素的极性运输。3.PtPIN1转毛白杨的表型有,植株高大健壮,叶片具粗锯齿且不对称生长,再生芽体聚集成花瓣状,有的芽体呈棒状,且玻璃化。幼芽白色,后期局部出现红褐色。生长素能够促进植物体的生长发育,调控叶片的极性建成以及叶和芽的发育。转基因植株的表型恰好与生长素的功能相符。这说明PtPIN1通过调控生长素极性运输来参与植物体的多种器官的生长发育过程。实验结果为我们研究PtAUX1和PtPIN1基因的功能提供了可靠的证据。PtAUX1和PtPIN1基因作为生长素的输入和输出载体,以特异的机制调控着生长素的极性运输,进而参与到植物体的生长发育过程中来。

全文目录


中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-27
  1.1 影响杨树木材性状基因的研究进展  13-14
    1.1.1 木质素合成酶类基因  13
    1.1.2 调节次生生长功能基因  13-14
    1.1.3 合成纤维素酶基因  14
  1.2 转基因杨树  14-18
    1.2.1 材性改良基因的研究进展  14-15
      1.2.1.1 纤维素基因改良工程  14-15
      1.2.1.2 木质素基因改良工程  15
    1.2.2 抗旱、抗盐碱基因的研究进展  15-16
      1.2.2.1 抗旱基因研究现状  15-16
      1.2.2.2 抗盐碱基因研究现状  16
    1.2.3 抗虫基因的研究进展  16-17
      1.2.3.1 Bt 抗虫基因的研究现状  16-17
      1.2.3.2 蛋白酶抑制剂 PI 的研究现状  17
      1.2.3.3 双价抗虫基因的研究现状  17
    1.2.4 转基因杨树的发展前景  17-18
  1.3 生长素的研究进展  18-26
    1.3.1 生长素运输的 3 条途径  19-20
    1.3.2 生长素的极性运输  20-22
      1.3.2.1 生长素的长距离极性运输  21
      1.3.2.2 生长素在维管组织中的非极性运输  21
      1.3.2.3 极性与非极途径的关联  21-22
    1.3.3 生长素极性运输与植物发育  22-23
      1.3.3.1 细胞分裂、分化与极性建立  22
      1.3.3.2 向性  22-23
      1.3.3.3 模式  23
    1.3.4 生长素输入载体  23-24
    1.3.5 生长素输出载体  24-26
      1.3.5.1 磷酸化作用  25
      1.3.5.2 NPA 的抑制作用  25
      1.3.5.3 生长素输入抑制剂  25
      1.3.5.4 生长素和其他激素的调节作用  25-26
  1.4 本研究的目的及意义  26-27
2 材料与方法  27-38
  2.1 实验材料  27
    2.1.1 植物材料及其生长条件  27
    2.1.2 菌株和质粒  27
    2.1.3 酶和生化试剂  27
    2.1.4 主要实验仪器  27
    2.1.5 PCR 引物  27
  2.2 实验方法  27-38
    2.2.1 植物的种植与培养  27-28
      2.2.1.1 拟南芥的种植与培养  27-28
      2.2.1.2 毛白杨的培养  28
    2.2.2 总 RNA 的提取  28-29
    2.2.3 cDNA 的合成  29
    2.2.4 目的基因的克隆  29-31
      2.2.4.1 PtPIN1 基因的克隆  29-30
      2.2.4.2 PtAUX1 基因的克隆  30-31
    2.2.5 表达载体的构建  31-32
      2.2.5.1 克隆载体的构建  31-32
      2.2.5.2 表达载体的构建  32
    2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  32-33
    2.2.7 碱法大量质粒 DNA 的提取  33
    2.2.8 农杆菌 GV3101 感受态细胞的制备和转化  33-34
      2.2.8.1 农杆菌 GV3101 感受态细胞的制备  34
      2.2.8.2 冻融法转化农杆菌  34
    2.2.9 农杆菌介导的毛白杨遗传转化  34-36
      2.2.9.1 毛白杨的培养  34
      2.2.9.2 叶盘法转化毛白杨  34-35
      2.2.9.3 转基因苗的驯化  35
      2.2.9.4 培养基类型  35-36
    2.2.10 农杆菌介导的拟南芥遗传转化  36-37
      2.2.10.1 拟南芥的培养  36
      2.2.10.2 转化拟南芥  36
      2.2.10.3 转基因植株的筛选  36-37
    2.2.11 检测转基因植株  37-38
      2.2.11.1 RT-PCR 检测转基因植株  37
      2.2.11.2 PtAUX1 转毛白杨植株表型分析  37
      2.2.11.3 PtPIN1 转毛白杨植株表型分析  37
      2.2.11.4 PtAUX1 转拟南芥植株表型分析  37-38
3 结果与分析  38-51
  3.1 生长素运输载体基因的克隆  38-43
    3.1.1 PtAUX1 基因的克隆  38-40
    3.1.2 PtPIN1 基因的克隆  40-43
  3.2 生长素运输载体基因表达载体的构建  43-45
    3.2.1 PtAUX1 基因表达载体的构建  43-44
    3.2.2 PtPIN1 基因表达载体的构建  44-45
  3.3 生长素运输基因转基因植株的表型分析  45-51
    3.3.1 PtAUX1 基因转毛白杨植株的表型分析  45-46
      3.3.1.1 PtAUX1 基因促进毛白杨幼苗子房的发生  45-46
      3.3.1.2 PtAUX1 基因促进毛白杨幼苗叶片的产生  46
      3.3.1.3 PtAUX1 基因诱导毛白杨幼苗体状胚的发生  46
    3.3.2 PtAUX1 基因转拟南芥植株的表型分析  46-49
      3.3.2.1 PtAUX1 基因对拟南芥根的影响  47
      3.3.2.2 PtAUX1 基因对拟南芥叶片的影响  47-48
      3.3.2.3 PtAUX1 基因对拟南芥表皮毛的影响  48
      3.3.2.4 PtAUX1 基因对拟南芥花器官发育的影响  48-49
    3.3.3 PtPIN1 基因转毛白杨的表型分析  49-51
      3.3.3.1 PtPIN1 基因促进毛白杨幼苗生长  49-50
      3.3.3.2 PtPIN1 基因影响毛白杨幼株叶片发育  50-51
      3.3.3.3 PtPIN1 基因影响毛白杨幼株芽体的分化  51
4 讨论  51-55
  4.1 生长素运输载体基因的序列分析  52
    4.1.1 PtAUX1 基因是生长素输入载体  52
    4.1.2 PtPIN1 基因是生长素输出载体  52
  4.2 生长素运输载体基因的功能分析  52-55
    4.2.1 PtAUX1 参与毛白杨根、茎、叶、花的发育  52-55
    4.2.2 PtPIN1 参与毛白杨植株生长、叶片极性建成以及花的发育  55
5 结论  55-57
参考文献  57-67
附录  67-70
致谢  70-71
攻读硕士学位期间发表论文情况  71

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶乔木 > > 毛白杨
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