学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

落叶松体细胞胚胎发生相关基因LaSERK1的表达模式及其抗体制备研究

作　者: 李龙
导　师: 韩素英
学　校: 中国林业科学研究院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 落叶松体细胞胚胎发生 LaSERK1 亚细胞定位原核表达
分类号: S791.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 30次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

落叶松（Larix spp.）是重要的速生造林树种，目前其体细胞胚胎发生作为一种新的繁殖技术已取得突破性进展。然而，胚性细胞诱导困难、畸形胚的出现和同步化困难等还是胚性细胞诱导过程中尚待解决的瓶颈问题，而分子机制的研究可能给体细胞胚胎发育带来新的变革。目前体细胞胚胎发育相关基因基因已经克隆到多个，但是大多数都是在体细胞胚胎发育后期起作用，SERK1是目前为止唯一发现在体细胞胚胎发育前期起作用的基因。SERK1基因是体胚发生早期的重要基因，因此研究落叶松SERK1基因在落叶松体细胞胚胎发生过程早期由愈伤组织转变为胚性细胞的过程中所起的作用对于落叶松体细胞胚胎发生的研究具有重要意义。本研究从体细胞胚胎发生相关受体类蛋白激酶SERK1入手，克隆了日本落叶松（Larix leptolepis）体细胞胚胎发生相关受体类蛋白激酶基因LaSERK1，对其进行了表达模式分析和原核表达并进行了抗体制备。主要研究结果如下：（1）克隆了落叶松体细胞胚胎发生相关受体类蛋白激酶LaSERK1基因，并将其翻译为蛋白后与其他物种SERK1进行了一级结构和高级结构比对，比对后发现它们有高度相似性；（2）qRT-PCR结果显示胚性细胞在含有脱落酸（Abscisic acid, ABA）激素的成熟培养基中培养时，LaSERK1在体胚发生早期高表达，但是在第七天时明显降低，之后的各阶段基本呈递减趋势。这些结果表明LaSERK1可能在落叶松体胚发育早期起重要作用；（3）当胚性细胞在无激素简单继代培养基中生长时，LaSERK1基因的表达比在含有2,4-D和BA的继代培养基中培养的细胞低很多，说明激素2,4-D和BA对LaSERK1基因的表达有一定的诱导作用；（4）构建了pSuper1300-GFP-LaSERK1亚细胞定位载体，证明LaSERK1定位在细胞膜上的，这也与其作为受体的功能相对应；（5）构建了LaSERK1蛋白胞外段原核表达载体pET28a(+)-His-ecLaSERK1，在体外对LaSERK1蛋白胞外段结构域进行了原核表达，并以此肽段为抗原制备了相关抗体，使用ELISA技术对其抗体进行了效价检测，得到较好的结果（效价1:2500），日后可以将此抗体用于对体细胞胚胎发育过程中各阶段LaSERK1蛋白表达量的Western blot检测以及用于免疫组化实验以研究体细胞胚胎发育过程中各阶段LaSERK1蛋白在胚团和成熟胚中的表达位置。综上所述，LaSERK1可能在落叶松体胚发育早期起重要作用，且在体胚发育过程中受ABA，2,4-D等激素的调控，LaSERK1也有可能成为早期胚性细胞的标记基因，且表达在细胞膜上，说明其在细胞感受外界信号过程中起作用。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-15
第一章绪论  15-27
  1.1 研究背景  15-19
    1.1.1 体胚发生相关基因进展  16-17
    1.1.2 LEA（晚期胚胎丰富蛋白）  17
    1.1.3 细胞骨架蛋白  17
    1.1.4 胁迫相关基因  17-18
    1.1.5 细胞壁合成相关蛋白  18-19
    1.1.6 钙离子和钙调素  19
  1.2 研究目的及意义  19-21
    1.2.1 研究目的  19-20
    1.2.2 研究意义  20-21
  1.3 国内外研究现状及评述  21-25
    1.3.1 SERK1 基因简介  21-22
    1.3.2 基因结构特征  22-23
    1.3.3 SERK1 基因的表达及调控  23-24
    1.3.4 SERK1 的信号传导  24-25
  1.4 研究内容  25-26
  1.5 技术路线  26
  1.6 项目来源及经费支持  26-27
第二章 LASERK1 的克隆、表达分析和亚细胞定位  27-55
  2.1 材料与方法  27-39
    2.1.1 实验材料  27-29
    2.1.2 主要试剂和仪器  29
    2.1.3 实验方法  29-39
  2.2 实验结果  39-51
    2.2.1 总 RNA 提取结果  39
    2.2.2 LaSERK1 基因片段（contig PEMC 22526）的 PCR 扩增结果  39-41
    2.2.3 RACE  41-42
    2.2.4 LaSERK1 编码序列 CDS 全长获得  42-43
    2.2.5 LaSERK1 生物信息学分析  43-47
    2.2.6 LaSERK1 基因的表达模式  47-50
    2.2.7 LaSERK1 的亚细胞定位  50-51
  2.3 讨论  51-53
    2.3.1 LaSERK1 的进化保守性  51-52
    2.3.2 LaSERK1 基因的表达特异性  52-53
    2.3.3 LaSERK1 蛋白亚细胞定位  53
  2.4 小结  53-55
第三章胞外段克隆、原核表达及抗体制备  55-67
  3.1 实验材料  55-57
  3.2 实验方法  57-61
    3.2.1 引物设计与扩增  57-58
    3.2.2 原核表达载体构建  58
    3.2.3 原核表达条件优化  58
    3.2.4 目的蛋白的表达检测  58-59
    3.2.5 ecLaSERK1 兔多克隆抗血清制备及效价检测  59-61
  3.3 实验结果  61-66
    3.3.1 LaSERK1 胞外段扩增  61-62
    3.3.2 ecLaSERK1 基因与克隆载体连接  62
    3.3.3 表达质粒的连接  62-63
    3.3.4 LaSERK1 的原核表达  63-64
    3.3.5 落叶松体细胞胚胎 LaSERK1 抗血清的制备及鉴定  64-66
  3.4 讨论  66
  3.5 小结  66-67
第四章结论  67-68
第五章展望  68-69
参考文献  69-78
附录 A 缩略词  78-79
附录 B ELISA 反应中试剂配方  79-81
附录 C MS 培养基配方  81-82
在读期间的学术研究  82-83
致谢  83-84
中文详细摘要  84-86

落叶松体细胞胚胎发生相关基因LaSERK1的表达模式及其抗体制备研究

内容摘要

全文目录

相似论文