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杉木转录组特征及R2R3-MYB基因的克隆和表达分析

作　者: 徐莉莉
导　师: 童再康
学　校: 浙江农林大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 杉木转录组测序 MYB 基因克隆表达分析烟草转基因
分类号: S791.27
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

杉木是我国特有的针叶速生用材树种，材性的遗传改良是其主要育种目标之一，育种者以杉木木材密度、色泽等性状改良为目标开展了大量的常规育种工作。近年，涉及木材性状形成的分子机制等相关研究已成为热点。本研究以杉木为材料，利用Illumina平台进行了转录组测序，获得了40217146个双端测序reads，生成了3.62Gb的原始数据以转录组测序获得的相关数据为基础，并进行组装，得到83248条Unigenes，平均长度为449bp。在注释的杉木Unigenes中，有14877条Unigenes在COG功能分类体系中具有具体的蛋白功能定义，而在GO功能分类体系中，有41902条Unigenes具有具体功能定义。通过Unigene数据库，大多数参与纤维素和木质素生物合成基因得到注释。在转录组测序的基础上，15个ClMYB基因的cDNA序列被成功分离。它们皆具有完整的ORF，且编码MYB蛋白都包含R2R3MYB结构域，与松科植物白云杉R2R3-MYB蛋白的DBD结构域序列一致性高达96%。对15个ClMYB基因的RT-PCR分析表明，它们在6个不同的器官中都有表达，ClMYB1、ClMYB3和ClMYB6在针叶中的表达量最高；ClMYB2、 ClMYB13和ClMYB14在根中的表达量最高；ClMYB5和ClMYB12在雌球花中的表达量最高，而ClMYB15在雄球花中的表达量最高，ClMYB11在根和雌球花中的表达量相同且都很高；而在ClMYB1和ClMYB2茎的表达结果中，且木质化茎的表达量都明显高于未木质化的茎。在对ClMYB1和ClMYB2进一步的定量PCR研究中发现了同样的规律，ClMYB1和ClMYB2都主要在木质部中表达，且两年生木质部中的表达量都高于一年生木质部中的表达量。经IAA、GA3和BR激素处理12小时后，ClMYB1和ClMYB2在木质部中的表达模式相似，均受到了诱导。在杉木应压木的诱导形成中，ClMYB1在处理第10天时，应压区的表达量是对应区的1.44倍；ClMYB2在应压区木质部中表现为下调表达。在ClMYB1和ClMYB2与13个杉木木质素合成相关酶基因的协同表达分析中，ClMYB1与ClC4H、ClCOMT、ClPAL3呈极显著正相关，ClC3H、ClCCoAOMT2之间呈显著相关，与ClPAL2显著负相关；ClMYB2与ClCAD1呈极显著正相关，与ClPAL2呈极显著负相关，与ClCCoAOMT2呈显著正相关，与Cl4CL呈显著负相关。这些结果显示，ClMYB1、 ClMYB2可能通过调控这些基因参与木质素的生物合成。转ClMYB1和ClMYB2基因的烟草植株花期延迟，植株矮化，叶形变大，叶柄更硬挺；转ClMYB1植株多数花而不实，结实量极低，转ClMYB2植株只开花不结实。转ClMYB1、ClMYB2基因烟草茎的切片染色实验中表明，转基因烟草中木质素的含量较之对照有所提高，说明ClMYB1、ClMYB2参与了调控木质素的生物合成。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
引言  10-11
文献综述  11-16
  1.1 杉木研究进展  11-12
    1.1.1 杉木的生物学特性及其分布  11
    1.1.2 杉木遗传育种研究进展  11-12
  1.2 木材形成分子机制研究进展  12-15
    1.2.1 木质素的生物合成  13
    1.2.2 木质素生物合成的转录调控  13-15
      1.2.2.1 MYB 类转录因子  13-14
      1.2.2.2 其他转录因子  14-15
  1.3 研究的目的与意义  15-16
第二章杉木转录组序列测定及其特征分析  16-23
  2.1 材料与方法  16-17
    2.1.1 植物材料和 RNA 提取  16
    2.1.2 测序文库的构建和转录组测序  16
    2.1.3 数据过滤和 de novo 拼接  16-17
    2.1.4 功能注释及分类  17
    2.1.5 代谢途径功能基因的分析  17
  2.2 结果与分析  17-21
    2.2.1 Illumina 双端测序和 de novo 拼接  17-19
    2.2.2 转录物功能注释及分类  19-21
    2.2.3 代谢途径功能基因的分析  21
  2.3 讨论  21-23
第三章杉木 R2R3-MYB 基因克隆及序列分析  23-34
  3.1 材料与方法  23-28
    3.1.1 材料  23
    3.1.2 总 RNA 的提取  23
    3.1.3 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA  23-24
    3.1.4 反转录 cDNA 第一链的合成  24-25
    3.1.5 目的基因全长 cDNA 的分离  25-28
      3.1.5.1 5' RACE 及 3' RACE  26
      3.1.5.2 ClMYB 序列的验证  26-27
      3.1.5.3 凝胶回收  27
      3.1.5.4 连接反应  27
      3.1.5.5 大肠杆菌感受态细胞的转化  27-28
      3.1.5.6 序列测定  28
      3.1.5.7 序列比较和分析  28
  3.2 结果与分析  28-32
    3.2.1 15 个 ClMYB 全长 cDNA 序列的分离  28-29
    3.2.2 ClMYB 全长 cDNA 的序列分析  29-30
    3.2.3 ClMYB 基因家族的进化树分析  30-32
  3.3 讨论  32-34
第四章杉木 ClMYB 基因的表达分析  34-45
  4.1 材料与方法  34-36
    4.1.1 实验材料  34
    4.1.2 激素处理  34
    4.1.3 应压木诱导处理  34-35
    4.1.4 总 RNA 的提取及 cDNA 第 1 链的合成  35-36
    4.1.5 ClMYB 基因组织特异性表达分析  36
  4.2 结果与分析  36-43
    4.2.1 不同器官和组织中 ClMYB 的表达差异  36-39
    4.2.2 不同木质部区域中 ClMYB1、 ClMYB2 的表达差异  39
    4.2.3 激素处理对 ClMYB1、 ClMYB2 表达的影响  39-40
    4.2.4 应压木形成中 ClMYB1、ClMYB2 的表达差异  40-41
    4.2.5 ClMYB1、 ClMYB2 与木质素合成相关酶的相关性分析  41-43
  4.3 讨论  43-45
第五章杉木 ClMYB1、ClMYB2 基因超表达载体的构建及烟草转化  45-54
  5.1 材料与方法  45-50
    5.1.1 菌株和质粒  45
    5.1.2 超表达载体的构建和鉴定  45-47
    5.1.3 重组农杆菌工程菌株获得  47-48
      5.1.3.1 农杆菌感受态细胞的制备  47-48
      5.1.3.2 重组质粒转化农杆菌感受态细胞及筛选鉴定  48
    5.1.4 农杆菌介导的烟草叶盘侵染  48-49
      5.1.4.1 农杆菌培养  48
      5.1.4.2 侵染  48
      5.1.4.3 共培养  48
      5.1.4.4 选择培养  48-49
      5.1.4.5 生根培养  49
      5.1.4.6 土壤种植  49
    5.1.5 转基因阳性植株的鉴定  49-50
      5.1.5.1 CTAB 法提取烟草 DNA 鉴定  49
      5.1.5.2 TRIzol 法提取烟草幼叶 RNA 鉴定  49-50
  5.2 结果与分析  50-53
    5.2.1 超表达载体的鉴定  50
      5.2.1.1 质粒 PCR 鉴定  50
      5.2.1.2 酶切鉴定  50
      5.2.1.3 测序鉴定结果  50
    5.2.2 转基因阳性植株的鉴定  50-51
      5.2.2.1 DNA 水平的 PCR 检测  51
      5.2.2.2 RNA 水平的 PCR 检测  51
    5.2.3 转基因烟草表型观察  51-52
    5.2.4 转基因烟草切片观察  52-53
  5.3 讨论  53-54
结论与展望  54-56
  6.1 主要研究成果  54-55
  6.2 研究展望  55-56
参考文献  56-64
附录  64-65
个人简介  65
论文发表情况  65
社会实践及学术交流活动  65-66
致谢  66

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