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绿竹及拟南芥SEP3蛋白原核表达、纯化及寡聚体分析

作　者: 周佳平
导　师: 林新春
学　校: 浙江农林大学
专　业: 森林培育
关键词: 绿竹 拟南芥 SEP3 多聚体
分类号: S795
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 23次
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内容摘要


竹类资源丰富，研究和开发利用的空间巨大。有关竹子开花生理过程的研究一定程度上受取样困难和相关基因组信息缺乏的限制，因此研究竹子开花中的关键因子是非常必要的。植物体内SEPALLATA3蛋白（简称SEP3）与其他蛋白或元件组装成多聚体复合物，SEP3蛋白自身或与其它蛋白是如何组装的，形成什么样的空间复合物尚不清楚，但其在植物开花生长中具有非常重要的作用。本实验构建了绿竹和拟南芥SEP3蛋白的原核表达载体，纯化可溶性SEP3蛋白并进行体外功能结构试验，探究SEP3蛋白结构与功能关系及多聚体的形成机制。主要结果如下：1．成功构建得到不同结构域的原核表达SEP3蛋白载体，以pET15b为表达载体，Rosetta为宿主表达细菌，20℃条件下1%IPTG诱导15h，纯化得到了高纯度的拟南芥和绿竹的M domain SEP3蛋白、IK domain SEP3蛋白和SEP3包涵体蛋白。2．通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱MALDI TOF MS指纹图谱分析，Mascot程序将得到的多肽片段与SwissProt数据库信息比对，验证原核表达蛋白为SEP3蛋白。3．SEP3蛋白N端具有与DNA特异性结合的M区，本实验将纯化得到的M domain SEP3蛋白与启动子特异序列CArG box DNA结合，通过凝胶阻滞实验验证了SEP3蛋白具有结合DNA的活性。4．分析凝胶过滤层析峰图显示绿竹和拟南芥SEP3蛋白具有多聚性，体外戊二醛交联和酵母双杂交试验表明SEP3蛋白以二聚体为基本作用元件存在，SEP3蛋白均一性不高，主要以26聚体存在，并且同源或异源互作与K结构域具有密切关系。拟南芥和绿竹分别属于双子叶植物和单子叶植物，AtSEP3和BoSEP3不仅序列高度同源，且蛋白结构也具有很高的一致性，本研究对于植物成花机制研究具有参考意义。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章 文献综述  11-23
  1.1 花发育的主要途径  11-12
  1.2 花器官的形成  12-14
    1.2.1 ABC 模型  12
    1.2.2 ABCDE 模型  12-13
    1.2.3 四聚体模型（Quanrtet model）  13-14
  1.3 MADS box 基因研究进展  14-18
    1.3.1 MADS box 基因  14-16
    1.3.2 TypeⅠ MADS 成员的研究进展  16
    1.3.3 MADS box 基因家族多重性及起源  16-17
    1.3.4 MADS 蛋白与 DNA 和异源蛋白结合  17-18
  1.4 SEP3 蛋白的研究现状  18-19
  1.5 竹子成花分子机理的研究进展  19-20
  1.6 研究的目的及意义  20
  1.7 竹子研究的局限性  20-22
  1.8 研究路线  22-23
第二章 绿竹 SEP3 蛋白原核表达纯化及多聚体分析  23-40
  2.1 材料和方法  23-33
    2.1.1 实验材料  23-24
    2.1.2 BoSEP3 表达载体构建  24-28
    2.1.3 BoSEP3 蛋白的表达和纯化  28-31
    2.1.4 BoSEP3 蛋白质结晶实验探索  31
    2.1.5 BoSEP3 蛋白的多聚体分析  31
    2.1.6 BoSEP3 同源互作检测  31-33
  2.2 结果与分析  33-38
    2.2.1 BoSEP3 重组质粒载体构建  33-34
    2.2.2 重组 BoSEP3 蛋白的可溶性条件优化  34
    2.2.3 BoSEP3G 和 BoSEP3H 可溶蛋白大量纯化  34-35
    2.2.4 BoSEP3 蛋白结晶探索  35
    2.2.5 BoSEP3 蛋白多聚体结果与分析  35-36
    2.2.6 BoSEP3 不同结构域之间酵母双杂交检测同源互作  36-38
  2.3 讨论  38-40
第三章 拟南芥 SEP3蛋白原核表达纯化及结构功能分析  40-63
  3.1 材料和方法  40-49
    3.1.1 实验材料  40-41
    3.1.2 AtSEP3 表达载体构建  41-44
    3.1.3 AtSEP3 蛋白的表达和纯化  44-45
    3.1.4 AtSEP3 蛋白结晶探索  45-47
    3.1.5 AtSEP3 蛋白多聚体分析  47-48
    3.1.6 AtSEP3 同源互作检测  48-49
  3.2 结果与分析  49-60
    3.2.1 AtSEP3 重组质粒载体构建  49-50
    3.2.2 AtSEP3 不同融合蛋白的可溶条件优化  50-51
    3.2.3 AtSEP3 蛋白的大量纯化  51-54
    3.2.4 肽质量指纹图谱鉴定重组蛋白  54-55
    3.2.5 AtSEP3 蛋白结晶探索  55-56
    3.2.6 AtSEP3 蛋白多聚体分析  56-57
    3.2.7 AtSEP3 不同结构域之间酵母双杂交检测同源互作  57-59
    3.2.8 M domain SEP3 蛋白具有 DNA 结合功能  59-60
  3.3 讨论  60-63
第四章 绿竹 SEP3 和拟南芥 SEP3蛋白异源二聚体分析  63-67
  4.1 材料和方法  63-64
    4.1.1 实验材料  63
    4.1.2 AtSEP3 和 BoSEP3 之间不同结构域双杂交检测异源互作  63-64
  4.2 结果与分析  64-66
    4.2.1 以绿竹 SEP3 为诱饵蛋白与拟南芥 SEP3 为猎物蛋白的双杂交  64-65
    4.2.2 以拟南芥 SEP3 为诱饵蛋白与绿竹 SEP3 为猎物蛋白的双杂交  65-66
  4.3 讨论  66-67
第五章 结论和展望  67-69
  5.1 结论  67
  5.2 展望  67-69
参考文献  69-75
附录  75-78
致谢  78-79
个人简介  79
在校期间发表论文情况  79

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 竹
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