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毛竹转录因子PeMYB2特性分析与功能初步研究

作　者: 肖冬长
导　师: 张智俊
学　校: 浙江农林大学
专　业: 森林培育
关键词: 毛竹 转录因子 胁迫 PeMYB2 原核表达 Tail-PCR Marker基因
分类号: S795.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


干旱、盐碱、极端温度等非生物胁迫是限制植物生长发育的重要因子，也是影响作物产量的主要胁迫因素。转录因子在转录水平上参与调控各种与抗逆相关的功能基因的表达，在抗逆胁迫中发挥着重要的作用。MYB转录因子是植物转录因子中最大的家族之一，在植物抗逆中重要的作用。本研究对毛竹转录因子PeMYB2功能初步研究，得出以下结果。(1)PeMYB2在不同胁迫条件下的表达模式显示，PeMYB2在高盐、冷、ABA逆境下，表达量都有明显的提高，说明PeMYB2可能是依赖ABA信息传导途径，参与毛竹高盐、低温胁迫的调控。(2)通过染色体步移TAIL-PCR方法，克隆获得PeMYB2启动子1457bp，其含有MYB的核心元件MBS、低温核心元件LTR、抗旱核心元件DRE、WRKY、脱落酸核心元件ABRE、茉莉酸核心元件CGTCA-motif、水杨酸应答核心元件TCA-element、赤霉素应答核心元件P-box，预测PeMYB2参与各种非生物胁迫的响应。(3)酵母转录激话活性分析表明，PeMYB2蛋白具有转录活性，并且转录激活区域在C端，说明PeMYB2蛋白能够激活下游报告基因的表达。(4)构建PeMYB2原核表达载体，PeMYB2全长蛋白在原核中不可溶，而PeMYB2结构域蛋白在原核中部分可溶。并发现PeMYB2在原核细胞表达后，提高了原核细胞在高盐下的存活率，进一步说明PeMYB2的抗盐相关性。(5)转PeMYB2过表达的拟南芥比野生拟南芥有更强的抗寒、抗盐能力，同RT-qPCR分析高盐胁迫信号通路相关Marker基因NXH1、SOS1、RD29A、COR15A的表达特性表明，PeMYB2参与抗逆基因的表达调控。上述结果表明，毛竹转录因子PeMYB2在毛竹应对非生物胁迫中起着重要的作用。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第一章 文献综述  10-19
  1.1 植物对胁迫的响应机制  10
  1.2 植物转录因子的研究进展  10-14
    1.2.1 植物抗逆转录因子的分类  10-12
      1.2.1.1 AP2/EREBP 类转录因子  10-11
      1.2.1.2 MYB 类转录因子  11
      1.2.1.3 bZIP 类转录因子  11
      1.2.1.4 WRKY 类转录因子  11-12
      1.2.1.5 NAC 类转录因子  12
    1.2.2 植物抗逆转录因子的结构  12-13
      1.2.2.1 DNA 结合区  12
      1.2.2.2 转录调控区  12
      1.2.2.3 核定位信号区  12-13
      1.2.2.4 寡聚化位点区  13
    1.2.3 植物转录因子在抗逆的作用与信号转导  13-14
  1.3 MYB 转录因子在植物的研究进展  14-17
    1.3.1 MYB 转录因子的结构特点  14-15
    1.3.2 MYB 转录因子功能  15-16
      1.3.2.1 参与植物初生和次生代谢调控  15
      1.3.3.2 调控细胞命运  15
      1.3.3.3 调控植物发育  15
      1.3.3.4 调控对生物和非生物胁迫的反应  15-16
    1.3.3 R2R3-MYB 转录因子在非生物胁迫中的研究进展  16-17
      1.3.3.1 R2R3-MYB 在干旱胁迫中的作用  16
      1.3.3.2 R2R3-MYB 在高盐胁迫中的作用  16-17
      1.3.3.3 R2R3-MYB 在调节低温耐受性的作用  17
  1.4 立题依据与意义  17-18
  1.5 技术路线  18-19
第二章 毛竹转录因子 PEMYB2 表达模式及转录激活特性分析  19-33
  2.1 材料  19-20
    2.1.1 植物材料  19
    2.1.2 菌株与质粒  19
    2.1.3 试剂  19
    2.1.4 仪器设备  19-20
    2.1.5 引物的设计与合成  20
  2.2 方法  20-24
    2.2.1 毛竹材料的处理及 RNA 的提取  20-21
      2.2.1.1 毛竹材料的处理  20-21
      2.2.1.2 毛竹 RNA 的提取和 cDNA 的合成  21
    2.2.2 毛竹 DNA 的提取  21-22
    2.2.3 PeMYB2 的序列分析  22
    2.2.4 启动子的克隆与分析  22-23
      2.2.4.1 启动子克隆的原理  22
      2.2.4.2 启动子克隆的步骤  22
      2.2.4.3 产物回收和测序  22
      2.2.4.4 启动子的序列分析  22-23
    2.2.5 PeMYB2 原核表达及原核胁迫生长  23-24
      2.2.5.1 PeMYB2 原核表达载体构建  23
      2.2.5.2 PeMYB2 原核诱导表达  23-24
      2.2.5.3 PeMYB2 原核盐胁迫生长  24
    2.2.6 PeMYB2 酵母单杂  24
      2.2.6.1 酵母单杂载体的构建  24
      2.2.6.2 酵母单杂转录激活实验  24
  2.3 结果与分析  24-31
    2.3.1 PeMYB2 序列生物信息学分析  24-26
      2.3.1.1 PeMYB2 序列分析  24-25
      2.3.1.2 PeMYB2 三级结构预测  25-26
      2.3.1.3 PeMYB2 序列比对与系统树构建  26
    2.3.2 PeMYB2 启动子的克隆与分析  26-28
      2.3.2.1 PeMYB2 启动子的克隆  26-27
      2.3.2.2 PeMYB2 启动子分析  27-28
    2.3.3 PeMYB2 蛋白原核表达及原核胁迫生长  28-30
      2.3.3.1 PeMYB2 蛋白原核表达  28-29
      2.3.3.2 PeMYB2 的原核胁迫生长  29-30
    2.3.4 胁迫下毛竹 PeMYB2 的表达模式  30
    2.3.5 PeMYB2 转录活性验证  30-31
  2.4 讨论  31-33
第三章 毛竹转录因子 PEMYB2 基因转拟南芥过表达初步分析  33-43
  3.1 材料  33-35
    3.1.1 植物材料  33
    3.1.2 菌株和质粒  33
    3.1.3 化学试剂和酶制剂  33
    3.1.4 仪器设备  33-34
    3.1.5 培养基  34
    3.1.6 引物的设计与合成  34-35
  3.2 方法  35-37
    3.2.1 双元表达载体的构建与鉴定  35
    3.2.2 农杆菌 GV3101 感受态的制备和转化  35-36
      3.2.2.1 农杆菌 GV3101 感受态的制备  35
      3.2.2.2 电转化农杆菌 GV3101 及检测  35-36
    3.2.3 农杆菌介导拟南芥的转化  36
      3.2.3.1 野生拟南芥的种植  36
      3.2.3.2 浸花法拟南芥的侵染  36
    3.2.4 阳性转 PeMYB2 基因拟南芥的筛选  36-37
      3.2.4.1 拟南芥的潮霉素筛选  36-37
      3.2.4.2 DNA 水平对转基因 T2 代植株的筛选  37
      3.2.4.3 RNA 水平对转基因 T2 代植株的筛选  37
    3.2.5 T2 代转基因拟南芥植株的非生物胁迫分析  37
    3.2.6 荧光定量 PCR 分析  37
  3.3 结果与分析  37-42
    3.3.1 双元植物表达载体 pCAMBIA1301+PeMYB2 构建与检测  37-38
    3.3.2 转基因拟南芥阳性植株的筛选  38-39
    3.3.3 PeMYB2 过表达转基因拟南芥的筛选和表型分析  39-40
    3.3.4 转基因拟南芥 L1 的抗非生物胁迫反应  40-41
      3.3.4.1 转基因拟南芥 L1 抗高盐 NaCl 反应  40
      3.3.4.2 转基因拟南芥 L1 抗冷反应  40
      3.3.4.3 转基因拟南芥 L1 抗旱反应  40-41
    3.3.5 高盐胁迫的下 Maker 基因的表达  41-42
  3.4 讨论  42-43
第四章 结论和展望  43-45
  4.1 结论  43
  4.2 展望  43-45
参考文献  45-52
附录  52-53
序列  53-56
个人简介  56
在校发表文章情况  56-57
致谢  57

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 竹 > 刚竹
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