学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

毛竹PIF类转座子的克隆与结构分析以及MLE转座子对毛竹基因组多态性的影响

作　者: 王月圆
导　师: 汤定钦
学　校: 浙江农林大学
专　业: 森林培育
关键词: PhPIF-1 Mariner-Like element 克隆染色体步移 SSAP 基因多态性
分类号: S795.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 13次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

P不稳定因子（P instability factor，PIF）是首先在玉米里发现的一类DNA类转座子，后来将结构相似、同源同类型的DNA转座子归类到一个新的家族，命名PIF类转座子。PIF类转座子结构由2个开放阅读框（ORF），TIR序列和TSD序列组成。Mariner-Like element(MLE)是自主转座子Tc1-mariner超家族中一个重要家族。其结构由位于转座子两端的末端颠倒重复序列（TIR），2个TIR中间的编码转座酶的结构域，转座子插入新位点时引起靶序列产生的TA重复序列（TSD）三部分组成。PIF类转座子和具有结构简单、转座子在基因组插入位点接近随机和异源转座率高这三个特点的MLE转座子，成为近几年研究的热点。本研究首次通过基于磁珠富集的染色体步移法从毛竹中分离到一个全长PIF类转座子（PhPIF-1）。PhPIF-1长5953bp，它有20bp不完整的末端反向重复序列（Terminal Inverted Repeats, TIRs）和3bp靶位点重复（Target Site Duplications, TSDs），PhPIF-1转座子也含有2个开放阅读框(Open Reading Frames,ORFs)，其中一个编码假定转座酶，具有来自植物基因组PIF/Harbinger家族典型的完整DDE结构域，另一个开放阅读框编码DNA结合蛋白，在这个ORF中含有7个终止密码子和2个移码突变，因此推测PhPIF-1转座子没有转座活性。本课题组克隆的3个MLE转座子，它们结构完整，序列保守。我们选取有丰富变型的毛竹为实验材料，利用SSAP (sequence-specific amplification polymorphism)技术研究转座子活动对毛竹及其变型基因组多态性的影响，一共扩增到356条带，其中有160条带是多态性条带，多态性的比率是44.9%，实验证明MLE转座子在毛竹及其变型基因组中广泛分布。毛竹在其适应环境和引种栽培过程中产生了很多变型，如叶色、杆色以及杆形等的变化，但这些变化不能稳定遗传，当外界环境改变时，这些变形就可能发生回复突变。推测转座子活动与毛竹表型变化存在着某种联系，因此挑取部分多态性片段测序，发现有4个插入位点位于基因内部，可能影响了基因表达模式的改变，但是没有找到毛竹表型变化与转座子活动存在直接联系的证据。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
文献综述  10-18
  1.1 转座子的分类  10-11
  1.2 PIF 类转座子  11-13
    1.2.1 PIF 转座子的结构和特点  11-12
    1.2.2 PIF 转座子分布与进化  12-13
  1.3 Mariner-like 转座子  13-15
    1.3.1 MLE 转座子的结构和特点  13-14
    1.3.2 MLE 转座子的分布以及进化  14-15
  1.4 转座子活性对植物表型的影响  15
  1.5 研究的目的和意义  15-18
第一章毛竹 PIF 类转座子的克隆与结构分析  18-33
  1 材料  18-20
    1.1 实验材料  18
    1.2 菌株与载体  18
    1.3 实验用酶  18
    1.4 实验所用试剂盒  18
    1.5 仪器与设备  18-19
    1.6 试剂配置  19-20
    1.7 引物与接头  20
  2 实验方法  20-26
    2.1 毛竹基因组步行文库的构建  20-22
      2.1.1 毛竹 DNA 提取  20-21
      2.1.2 基因组 DNA 酶切  21
      2.1.3 纯化酶切产物  21-22
      2.1.4 酶切产物加接头  22
    2.2 通过基于磁珠富集的染色体步移法延伸所扩增片段 PhPIFa  22-26
      2.2.1 第一次 PCR  22-23
      2.2.2 第一次 PCR 产物回收  23
      2.2.3 第二次 PCR  23-24
      2.2.4 第二次 PCR 产物纯化及克隆  24-25
      2.2.5 测序分析  25
      2.2.6 扩增片段的拼接、全长 PIF 类转座子的结构分析  25-26
  3 结果与分析  26-33
    3.1 步行文库构建  26
    3.2 PhPIFa 的延伸  26-27
    3.3 测序结果与序列分析  27-33
      3.3.1 全长 PIF 类转座子的序列与结构分析  27-28
      3.3.2 PhPIF-1 与玉米、水稻和拟南芥 PIF 类转座子的 ORF 比对  28-31
      3.3.3 PhPIF-1 进化分析  31-33
第二章 MLE 转座子对毛竹基因组多态性的影响  33-50
  1 材料  33-35
    1.1 实验材料  33
    1.2 菌株与载体  33
    1.3 各种酶类  33-34
    1.4 试剂盒  34
    1.5 主要仪器与设备  34
    1.6 主要试剂  34
    1.7 接头与引物  34-35
      1.7.1 接头序列  34
      1.7.2 接头引物和转座子特异引物  34-35
  2 实验方法  35-40
    2.1 毛竹及其变种 DNA 的提取  35
    2.2 酶切基因组 DNA  35-36
    2.3 酶切产物纯化  36
    2.4 接头制备  36
    2.5 连接反应  36-37
    2.6 连接产物纯化  37
    2.7 预扩增  37
    2.8 选择性扩增  37-38
    2.9 扩增产物的检测  38-40
      2.9.1 水平电泳检测  38
      2.9.2 聚丙烯酰胺凝胶检测  38-40
    2.10 多态性条带回收测序  40
  3 结果与分析  40-50
    3.1 实验材料 DNA 提取  40-41
    3.2 基因组酶切  41-42
    3.3 预扩增反应  42
    3.4 不同引物组合对 PCR 扩增的影响  42-43
    3.5 多态性位点检测  43-45
    3.6 数据统计与分析  45-48
    3.7 差异片段的克隆和序列分析  48-50
结论与讨论  50-52
  利用磁珠富集技术做基因组步移，可有效获扩增长片段序列  50
  垂直失活可能是 PhPIF-1 转座子转座酶变异原因之一  50
  MLE 转座子插入多态性与毛竹形态变异的关系  50-52
参考文献  52-55
个人简介  55
在校期间发表论文情况  55-56
致谢  56

毛竹PIF类转座子的克隆与结构分析以及MLE转座子对毛竹基因组多态性的影响

内容摘要

全文目录

相似论文