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花叶矢竹叶绿素生物合成关键基因PjPORB和PjCAO的克隆与功能分析

作　者: 姜可以
导　师: 方伟
学　校: 浙江农林大学
专　业: 森林培育
关键词: 花叶矢竹 PjPORB PjCAO 基因克隆实时定量RT-PCR 转基因
分类号: S795
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

叶绿素(Chlorophyll, Chl)合成影响植物光合效率，是影响作物产量的重要因素。Chl生物合成途径（L-谷氨酰-tRNA→叶绿素a→叶绿素b）总共15步反应，涉及15种酶的参与,其中任何一个编码这些酶的基因发生突变都可能会引起叶片Chl的含量发生变化,从而表现为叶色异常甚至导致植株死亡。花叶矢竹(Pseudosasa japonica cv.Akebonosuji)叶色在生长发育过程中，呈现绿色、白色、绿白相间条纹（条纹的深浅、形状和出现个数和位置都具有不确定性），前期的叶绿素前体物质测定结果表明花叶矢竹叶色的异常可能与其叶绿素生物合成途径原叶绿素酸酯氧化还原酶（POR）和叶绿素酸酯a氧化酶（CAO）催化步骤的异常有关，本研究从这两个关键酶的编码基因PjPORB和PjCAO的分离入手开展了工作，主要结论如下：1.通过RACE方法克隆到了花叶矢竹叶绿素生物合成途径中两个关键基因PjPORB和PjCAO的全长cDNA。PjPORB基因的cDNA全长1567bp，含有一个1185bp的ORF区，编码394个氨基酸，包含SDR家族典型的Rossmann折叠NAD(P)结合位点和活性位点；PjCAO基因的cDNA全长2070bp，含有一个1626bp的ORF区，编码541个氨基酸，包含4个domain：前导肽序列，Adomain，B domain和C domain，其中C domain含有一个典型的Rieske铁硫配位中心。2.通过实时定量RT-PCR，分析了PjPORB和PjCAO在花叶矢竹根、茎和绿叶、白叶、花叶（绿条纹占叶面积大约70%以上的花叶和白条纹占叶面积大约70%以上花叶）的表达模式，结果显示PjPORB和PjCAO基因在花叶矢竹不同组织均有表达，在不同叶色叶片的发育过程中，PjPORB基因的mRNA水平呈现先升高后降低的趋势，PjCAO基因的mRNA水平呈现逐渐升高的趋势，并且表达程度各不相同，表明PjPORB和PjCAO基因可能通过影响叶绿素合成而在花叶矢竹叶片呈色过程中发挥了重要作用。3.通过农杆菌介导的浸花法将构建好的植物表达载体pC1301-PjPORB和pC1301-PjCAO转化野生型拟南芥。潮霉素对种子的抗性筛选以及GUS染色、PCR和RT-PCR对再生植株的阳性鉴定表明PjPORB和PjCAO基因已成功转化拟南芥。对性状较稳定的T1代转基因植株的叶绿素含量测量结果表明，过表达PjPORB和PjCAO拟南芥植株的叶绿素含量较野生型高，说明PjPORB和PjCAO基因可能参与了拟南芥的叶绿素生物合成过程，加深了我们对植物（特别是竹类植物）叶绿素生物合成和光合作用过程的理解和认识。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
第一章文献综述  9-16
  1.1 叶绿素  9-10
  1.2 叶绿素的生物合成及相关酶基因的克隆  10-12
    1.2.1 谷氨酸→胆色素原  11
    1.2.2 胆色素原→原卟啉Ⅸ  11-12
    1.2.3 原卟啉Ⅸ→叶绿素酸酯 a  12
    1.2.4 叶绿素酸酯 a→叶绿素 a 和叶绿素 b  12
  1.3 原叶绿素酸酯氧化还原酶(POR)  12-13
    1.3.1 原叶绿素酸酯氧化还原酶的生物学功能  12-13
    1.3.2 原叶绿素酸酯氧化还原酶基因的研究进展  13
  1.4 叶绿素酸酯 a 氧化酶（CAO）  13-14
    1.4.1 叶绿素酸酯 a 氧化酶的生物学功能  13-14
    1.4.2 叶绿素酸酯 a 氧化酶基因的研究进展  14
  1.5 研究目的与意义  14-15
  1.6 技术路线  15-16
第二章原叶绿素酸酯氧化还原酶基因和叶绿素酸酯 A 氧化酶基因的克隆与序列分析  16-42
  2.1 试验材料  16-18
    2.1.1 植物材料与菌株  16
    2.1.2 仪器与试剂  16
    2.1.3 基因克隆引物设计  16-18
  2.2 试验方法  18-28
    2.2.1 总 RNA 的提取及 cDNA 的合成  18-19
    2.2.2 基因保守区序列的 RT-PCR 扩增  19-20
    2.2.3 5' RACE 扩增 PjPORB 和 PjCAO 基因 5'端序列  20-24
    2.2.4 3' RACE 扩增 PjPORB 和 PjCAO 基因 3'端序列  24-25
    2.2.5 PjPORB 和 PjCAO 基因 ORF 的扩增  25-26
    2.2.6 PCR 产物回收  26
    2.2.7 回收产物与载体连接  26
    2.2.8 大肠杆菌感受态的制备  26-27
    2.2.9 连接产物转化及阳性克隆筛选  27
    2.2.10 菌检及测序  27
    2.2.11 基因序列生物学信息学分析  27-28
  2.3 结果与分析  28-40
    2.3.1 总 RNA 的提取  28
    2.3.2 基因保守区的扩增  28-29
    2.3.3 基因 5’ RACE  29-30
    2.3.4 基因 3’RACE  30-32
    2.3.5 基因 ORF 区的扩增  32-36
    2.3.6 基因的序列分析  36-40
  2.4 讨论  40-42
第三章 PJPORB 和 PJCAO 基因的时空表达谱  42-48
  3.1 试验材料  42-43
    3.1.1 植物材料  42
    3.1.2 仪器与试剂  42-43
    3.1.3 定量 RT-PCR 引物设计  43
  3.2 试验方法  43-44
    3.2.1 提取总 RNA  43
    3.2.3 cDNA 链的合成  43
    3.2.4 实时定量 RT-PCR  43-44
  3.3 结果与分析  44-46
    3.3.1 PjPORB 基因表达分析  44-45
    3.3.2 PjCAO 基因表达分析  45-46
  3.4 讨论  46-48
第四章农杆菌介导 PJPORB 和 PJCAO 基因遗传转化拟南芥  48-63
  4.1 试验材料  48-49
    4.1.1 植物材料与菌株  48
    4.1.2 试剂与仪器设备  48
    4.1.3 植物表达载体构建引物的设计  48-49
  4.2 试验方法  49-55
    4.2.1 质粒的提取  49-50
    4.2.2 ORF 区酶切位点的添加  50
    4.2.3 基因和 pC1301 的限制性酶切处理  50-51
    4.2.4 酶切产物的回收  51-52
    4.2.5 酶切产物的连接  52
    4.2.6 连接产物转化大肠杆菌及阳性克隆筛选  52
    4.2.7 菌检及测序  52
    4.2.8 电击法农杆菌感受态的制备  52-53
    4.2.9 植物表达载体转化农杆菌及阳性克隆筛选  53
    4.2.10 农杆菌菌液提取质粒及 PCR 验证  53
    4.2.11 拟南芥植株的培养  53-54
    4.2.12 浸花法介导拟南芥的遗传转化  54
    4.2.13 转基因种子的筛选  54
    4.2.14 转基因再生植株的验证  54-55
    4.2.15 纯系转基因植株的获得  55
    4.2.16 转基因植株叶绿素含量 (SPAD 值)的测定  55
  4.3 结果与分析  55-61
    4.3.1 植物表达载体的构建  55-58
    4.3.2 转基因种子的抗性筛选  58-59
    4.3.3 转基因再生植株的验证  59-61
    4.3.4 T1 代转基因再生植株的获得  61
    4.3.5 T1 代转基因植株的叶绿素含量(SPAD 值)  61
  4.4 讨论  61-63
第五章结论与展望  63-65
  5.1 研究结论  63
  5.2 研究展望  63-65
参考文献  65-68
个人简介  68-69
在校期间发表论文情况  69-70
致谢  70

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