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分子生物学方法在提高芒果产量研究中的应用

作　者: Md.Sorof Uddin
导　师: 程奇
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 芒果(Mangifera indica L.) ISSR 18SrRNA RAA 分子标签非加权组平均法育种
分类号: S667.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

芒果(Mangifera indica L.; Anacardiaceae)是最具有经济价值的水果之一。芒果在热带和亚热带地区都是非常重要的作物,特别是在亚洲被誉为“水果之王”。大部分的芒果品种都是异花授粉植物,通过选择性杂交合适的野生品种而得到的。目前,传统的育种方法是开发新品种最好的方式之一。然而,在芒果的传统育种方式的操作过程中存在着一些问题,这些问题影响了芒果改良的成功率。在进行传统育种之前,了解各个品种之间的关系能够提高杂交的成功率,因此是非常重要的一步。为此,在本研究中,我们利用14个简单序列重复区间(inter simple sequence repeats, ISSRs)和18Sr RNA引物检测了来自孟加拉国西北部和中国广西省的23个芒果品种的遗传多样性和相关性。我们还应用了一种简单有效的核酸扩增方法RAA来进行DNA的扩增。进行任何分子生物学研究,高质量的基因组DNA的得到都是第一步。基因组DNA的质量不佳会影响以DNA为研究基础的分析研究的成功进行。传统的DNA提取方法并不适合从成熟的芒果叶片中提取DNA,因为成熟的芒果叶片中常含有的次级代谢产物会影响下游实验的展开。本论文中,我们利用改良的CTAB DNA提取法来进行DNA的提取,即在传统的DNA提取方法的基础上添加了一步来去除叶片组织中提取得到的基因组DNA中的多糖、多酚以及次级代谢产物等。与传统的CTAB DNA提取法相比,0.4M葡萄糖能够避免污染及多酚的着色,从而提高DNA的质量。该改良的DNA提取法还被用来从其他木本多年生植物,如核桃、番石榴、荔枝、梨、葡萄和甘蔗中提取高纯度基因组DNA。在14对ISSR引物标签中,6对引物显示可重复的多态性的DNA扩增型,因此被应用来构建分辨芒果基因型的DNA指纹表格。利用这6对引物,共生成51条条带,其中48条(94.11%)是多态性。在以PCR为基础的方法中,ISSR已经被证明为一种研究遗传多样性的新方法。分子标签的使用提供了一种具有吸引力,切实有效且更可靠的形态学标签。在本文中,所有检测的品种显示的带型都与其他品种不同,即显示充足的多样性,证明ISSR-PCR是一种非常有效的检测芒果多样性的方法。在泰国、澳大利亚、中国以及印度,ISSR被广泛的用于芒果多样性的鉴别、遗传多样性以及相关性分析。利用非加权组平均法(unweighted pair group with arithmetic means, UPGMA)进行分析,上述23个芒果品种被归类为四组。我们还利用18SrRNA基因序列来分析芒果品种间的遗传多样性和相关性。核酸的扩增对于核酸的检测来说是关键性的一步。目前常用的方法需要精密的仪器或者非常复杂的实验步骤,因此它们的使用被局限在了实验室中。连续性的供电是非常昂贵并且对于一些国家和地区是相对难以实现的。我们的研究中,利用了一种新的核酸扩增方法：重组酶辅助扩增(RAA),该方法能够快速有效地进行DNA的扩增。对于RAA成功扩增的影响因素的研究非常必要,有许多因素都会影响到成功的扩增,而引物长度是其中比较重要的一个。我们设计了18对引物,其中4对引物含有不同的碱基数目,并以芒果(Mangifera indica L.)、核桃(Juglans regia L.)、梨(Pyrus communis L.)、葡萄(Vitis vinifera)、番石榴(Psidium guajava)、荔枝(Litchi chinensis)和甘蔗(Saccharum officinarum L.)基因组为模板进行了扩增。实验结果显示,18-28bp的引物长度均能够实现成功扩增。我们根据Guti品种的18S rRNA序列设计了特异性引物并扩增得到了上述23种芒果品种的18S rRNA基因序列。我们对上述23种芒果品种的18S rRNA基因序列进行了测序,测序结果已经上传到了NCBI GenBank数据库中,登记号为KC793984至KC794006。本文所得结果及上传至数据库中的结果应该会对针对芒果的进一步分子生物学研究有所助益。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-18
第一章 CHAPTER Ⅰ INTRODUCTION  18-37
  1.1 Mango  18
  1.2 Origin and distribution  18
  1.3 Present status of mango production in Bangladesh  18-19
  1.4 Present status of mango production in China  19
  1.5 Importance of mango worldwide  19-20
    1.5.1 Economy  19
    1.5.2 Nutritional value  19-20
  1.6. Cultivar characterization  20-21
    1.6.1 Morphological characterization  21
  1.7 Mango varieties/cultivars grown in different regions around the world  21-22
  1.8. Mango tree description  22-24
    1.8.1 Tree  23
    1.8.2 Root  23
    1.8.3 Leaf  23
    1.8.4 Inflorescence and flowers  23-24
    1.8.5 Pollen and pollinatiin  24
    1.8.6 Fruit  24
  1.9. Genetic characterization  24-25
    1.9.1 Cytology  24
    1.9.2 Genetic diversity  24-25
  1.10 Moleculaar markers  25-29
    1.10.1 Isozyme marker  25
    1.10.2 Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)  25-26
    1.10.3 Random Amplified Polymorphic DNA  26-27
    1.10.4 Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP)  27-28
    1.10.5 Simple Sequence Repeats(SSRs)  28
    1.10.6 Inter Simple Sequence Repeats(ISSRs)  28-29
    1.10.7 Start Codon Targeted(SCoT)primers  29
  1.11 Mango Breeding  29-32
    1.11.1 Breeding objectives  29-30
    1.11.2 Methods of mango breeding  30-31
    1.11.3 Breeding achievements  31-32
    1.11.4 Problems associated with mango breeding  32
  1.12 Breeding for major insect-pests and diseases  32-36
    1.12.1 Mango seed weevil  32-33
    1.12.2 Fruit flies  33
    1.12.3 Anthracnose disease  33-34
    1.12.4 Gummosis disease  34-35
    1.12.5 Powdery Mildew  35-36
  1.13 Hypothesis  36
  1.14 Objectives  36-37
第二章 CHAPTER Ⅱ A simple and efficient method to extract genomic DNA frommango  37-45
  Summary  37
  2.1 Introduction  37-38
  2.2 Materials and Methods  38-40
    2.2.1 Plant material  38
    2.2.2 Reagents  38
    2.2.3 Genomic DNA extraction using new method  38-39
    2.2.4 ISSR-PCR amplification  39
    2.2.5 18S rRNA-PCR amplification  39
    2.2.6 Agarose gel electrophoresis  39-40
  2.3 Results  40-43
  2.4 Discussion  43-44
  2.5 Conclusion  44-45
第三章 CHAPTER Ⅲ Effect of primer length for the successful amplification onRecombinase-Aid Amplification(RAA) reaction applied to different crops  45-50
  Summary  45
  3.1 Introduction  45-46
  3.2 Materials and Methods  46-47
    3.2.1 Plant Material  46
    3.2.2 Reagents required  46
    3.2.3 Genomic DNA Isolation and Purification  46-47
    3.2.4 RAA reaction  47
  3.3 Results and Discussions  47-49
  3.4 Conclusions  49-50
第四章 CHAPTER Ⅳ Genetic diversity analysis of 23 mango cultivars using intersimple sequence repeats (ISSRs) and 18SrRNA  50-70
  Summary  50
  4.1 Introduction  50-52
  4.2 Materials and Methods  52-63
    4.2.1 Plant materials  52-53
    4.2.2 Reagents required  53-54
    4.2.3 DNA extraction  54
    4.2.4 ISSR analysis  54-55
    4.2.5 18S rRNA-RAA reaction  55
    4.2.6 Agarose gel electrophoresis  55
    4.2.7 Sequencing of rDNA amplicon  55-63
    4.2.8 Data analysis  63
  4.3 Results  63-68
    4.3.1 Screening of primers and diversity analysis of mango  63-65
    4.3.2 Cluster analysis  65-68
  4.4 Discussions  68-69
  4.5 Conclusion  69-70
全文结论 GENERAL CONCLUSIONS  70-71
参考文献 REFERENCES  71-82
致谢 ACKNOWLEDGEMENTS  82-83
作者简历 RESUME  83-87

分子生物学方法在提高芒果产量研究中的应用

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