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一氧化氮对桃果实三羧酸循环相关酶活性及蛋白质结构的影响

作 者: 马春媚
导 师: 朱树华
学 校: 山东农业大学
专 业: 分析化学
关键词: 肥城桃 三羧酸循环 一氧化氮 酶活性 表面等离子共振 蛋白质相互作用 柠檬酸合酶 苹果酸脱氢酶
分类号: S662.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


本实验研究了NO对采后肥城桃果实线粒体三羧酸循环相关酶活性的影响。在4oC条件下,用0、5、15和30μL L-1的NO分别处理6、12、18、24、30天,检测不同NO浓度和时间处理条件下丙酮酸脱氢酶系和三羧酸循环中一系列相关酶活性的影响。结果表明在整个处理期间,三种不同浓度的NO处理均可以促进丙酮酸脱氢酶系和延胡索酸酶活性,5和15μL L-1NO处理的柠檬酸合酶活性较对照有轻微提高。30μL L-1NO处理则很明显地抑制了琥珀硫激酶和琥珀酸脱氢酶的酶活性。15μL L-1NO处理12天后可以促进对顺乌头酸酶、α-酮戊二酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶酶活性,但是在前12天不同浓度NO抑制了顺乌头酸酶活性。15和30μL L-1NO处理6天后,可以使异柠檬酸脱氢酶活性显著升高,并且在第12和24天后迅速降低。实验结果表明,不同NO处理浓度和时间对三羧酸循环相关酶的活性有不同影响。另外,用毛细管电泳检测有机酸含量表明,30和5μL L-1NO处理分别在第18和24天琥珀酸含量有显著的积累。实验表明,NO可与线粒体中多种酶发生作用,通过抑制琥珀硫激酶和琥珀酸脱氢酶活性控制三羧酸循环,并且NO对琥珀酸脱氢酶活性抑制作用大于对琥珀硫激酶活性的抑制,造成琥珀酸的积累。线粒体苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶是三羧酸循环中按顺序相连的两个酶,本实验应用表面等离子共振技术和聚乙二醇沉淀法检测mMDH和CS在中的相互作用。采用共价键偶联法使11-巯基十一烷酸末端巯基与金膜形成牢固的Au-S键,将mMDH结合在芯片上,然后在线检测mMDH和CS的结合情况。结果表明SPR可以检测到mMDH和CS发生相互作用,并且,NO处理后可以使相互作用加强。用80mmol L-1NO处理mMDH、CS和mMDH+CS复合物的酶活性,检测结果表明,NO对mMDH活性没有显著的影响;对CS的活性有显著的促进作用,为对照组的3.4倍;由于mMDH和CS催化三羧酸循环中的连续反应,对mMDH+CS复合物活性也有明显的促进作用,为对照组的1.25倍。推测出NO可以增强mMDH和CS的相互作用。由于酶之间的结合形成草酰乙酸(OAA)的通路,这个通路的存在使中间产物可以很容易的通过两个酶,这样mMDH产生的产物就可以直接作为底物提供给CS,对新陈代谢的直接转换有重要作用。圆二色谱结果表明,NO明显改变了CS和mMDH的二级结构。计算机模拟图直观的显示了NO对mMDH和CS影响,可看出NO和CS的活性中心的Asn242形成共价键,存在较强的相互作用力;而NO和mMDH之间不存在明显的相互作用。可以推测NO和CS的相互作用是导致酶复合物活性升高的主要原因。

全文目录


中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1 引言  12-28
  1.1 三羧酸循环概念及作用  12-18
    1.1.1 丙酮酸脱氢酶系  12-13
    1.1.2 柠檬酸合酶  13-14
    1.1.3 柠檬酸异构化生成异柠檬酸  14
    1.1.4 异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸  14-15
    1.1.5 α-酮戊二酸氧化脱羧反应  15
    1.1.6 琥珀酸的生成  15
    1.1.7 琥珀酸脱氢生成延胡索酸  15-16
    1.1.8 苹果酸的生成  16
    1.1.9 草酰乙酸的再生  16-17
    1.1.10 三羧酸循环的特点及生物学意义  17-18
  1.2 三羧酸循环代谢物有机酸的检测  18-20
    1.2.1 有机酸检测手段  18-19
    1.2.2 毛细管电泳检测有机酸  19-20
  1.3 三羧酸循环中的蛋白质相互作用  20-22
    1.3.1 三羧酸循环中存在的蛋白质相互作用  20-21
    1.3.2 mMDH 和 CS 的蛋白质相互作用研究  21-22
  1.4 NO 在动植物中的应用  22-24
  1.5 表面等离子体共振检测蛋白质相互作用  24-25
    1.5.1 SPR 检测原理  24-25
    1.5.2 SPR 检测应用  25
  1.6 圆二色谱检测 NO 对 mMDH 和 CS 二级结构的影响  25-27
    1.6.1 CD 基本原理  26
    1.6.2 CD 在检测蛋白质结构中的应用  26-27
  1.7 论文研究内容及意义  27-28
2 材料方法  28-37
  2.1 仪器与试剂  28
  2.2 样品处理  28-29
  2.3 试验方法  29-37
    2.3.1 TCA 相关酶的提取及活性测定  29-32
    2.3.2 有机酸的测定  32-33
    2.3.3 SPR 生物传感器测定 mMDH 与 CS 相互作用  33-35
    2.3.4 酶复合物活性检测  35-36
    2.3.5 CD 检测 CS 和 mMDH 的二级结构  36-37
3 结果分析  37-50
  3.1 NO 对桃果实三羧酸循环相关酶活性的影响  37-43
    3.1.1 NO 对桃果实三羧酸循环丙酮酸脱氢酶系活性的影响  37
    3.1.2 NO 对桃果实三羧酸循环柠檬酸合酶活性的影响  37-38
    3.1.3 NO 对桃果实三羧酸循环顺乌头酸酶活性的影响  38-39
    3.1.4 NO 对桃果实三羧酸循环异柠檬酸脱氢酶活性的影响  39
    3.1.5 NO 对桃果实三羧酸循环α-酮戊二酸脱氢酶活性的影响  39-40
    3.1.6 NO 对桃果实三羧酸循环琥珀硫激酶活性的影响  40-41
    3.1.7 NO 对桃果实三羧酸循环琥珀酸脱氢酶活性的影响  41
    3.1.8 NO 对桃果实三羧酸循环延胡索酸酶活性的影响  41-42
    3.1.9 NO 对桃果实三羧酸循环苹果酸脱氢酶活性的影响  42-43
  3.2 NO 对桃果实三羧酸循环代谢物含量的影响  43
  3.3 SPR 检测 mMDH 和 CS 相互作用  43-46
    3.3.1 SPR 检测 mMDH 和 CS 相互作用  43-45
    3.3.2 NO 对蛋白质复合物活性的影响  45-46
  3.4 NO 对 mMDH、CS 和 mMDH+CS 二级结构的影响  46-48
    3.4.1 圆二色谱结果  46
    3.4.2 NO 对 mMDH 二级结构的影响  46-47
    3.4.3 NO 对 CS 二级结构的影响  47-48
    3.4.4 NO 对 mMDH+CS 二级结构的影响  48
  3.5 计算机模拟 NO 对 CS 和 mMDH 的作用  48-50
4 讨论  50-54
  4.1 NO 对三羧酸循环相关酶活性及代谢物的影响  50-52
  4.2 NO 对 mMDH、CS 和 mMDH+CS 二级结构的影响  52
  4.3 计算机模拟 NO 对 CS 和 mMDH 的作用  52-54
5 结论  54-55
本论文的创新点  55-56
参考文献  56-66
致谢  66-67
攻读硕士期间发表论文情况  67

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 核果类 >
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