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大豆耐盐相关基因GmVP、GmCHR、GmUsp1的克隆和初步功能验证

作 者: 黄姗
导 师: 侯文胜
学 校: 中国农业科学院
专 业: 作物遗传育种
关键词: 大豆 盐胁迫 GmVP GmCHR GmUsp1
分类号: S565.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
下 载: 25次
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内容摘要


盐碱地作为一种重要的土壤类型,占据陆地面积的6%,有近50%灌溉农田受到盐碱条件影响。受自然和耕作等因素的影响,受盐碱影响的耕地面积还在不断增加,对农作物的种植造成严重的威胁。大豆作为一种重要的粮食作物和经济作物,土壤盐碱化对其生长发育、产量和品质均会产生重要影响。栽培大豆中耐盐品种匮乏,开展大豆耐盐基因挖掘和基因工程研究具有重要意义。本研究在前期研究基础上,克隆并获得了3个大豆耐盐相关基因,并初步分析了其功能和潜在育种应用价值。通过对大豆盐胁迫抑制差减杂交文库EST序列筛选,克隆获得了3个大豆耐盐相关的基因,分别命名为GmVP、GmCHR、GmUsp1。同源比对分析认为其分别属于氢离子焦磷酸酶类、NADPH依赖的醛酮还原酶类、胁迫应激蛋白类基因。亚细胞定位结果显示GmVP定位于细胞膜结构,GmVP基因过表达能提高盐胁迫下发状根的相对伸长率,提高发状根的耐盐性。且过表达GmVP基因的发状根在50mmol/L NaCl、100mmol/L KCl、1mmol/L KCl胁迫处理后,其Na~+、K~+离子含量相比对照有较大变化,GmVP基因的过表达能调节发状根在胁迫处理后K~+、Na~+离子的平衡,有助于维持胁迫下离子稳态,并能提高SOD、POD、CAT活性和减低MDA含量。GmCHR过表达能在一定程度上提高大豆根系在盐胁迫下根的相对伸长率,从而提高大豆根系的耐盐性。前期研究已初步证实了GmPIP过表达能提高大豆根系和模式植物百脉根的耐盐性,本研究中进一步构建了GmPIP基因的植物表达载体,并利用根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化系统获得了3株T0代转基因植株,并通过160mg/L草丁膦涂抹检测、PCR检测进行了验证,为进一步研究GmPIP基因的功能和耐盐转基因品系选育提供了研究材料。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章 绪论  11-20
  1.1 盐胁迫对植物的影响  11-12
  1.2 植物应对盐胁迫的反应机制  12
  1.3 不同类型的植物耐盐性  12
  1.4 植物对盐胁迫的信号转导途径  12-15
    1.4.1 SOS 信号转导途径  12-14
    1.4.2 MAPK 级联途径  14
    1.4.3 Ca2~+及钙调素信号途径  14-15
  1.5 植物耐盐基因研究现状  15-18
    1.5.1 离子转运相关  15-16
    1.5.2 渗透调节相关  16-17
    1.5.3 氧化还原修复相关  17-18
    1.5.4 转录因子类  18
  1.6 农杆菌介导的遗传转化  18-19
    1.6.1 发根农杆菌转化  18
    1.6.2 根癌农杆菌转化  18-19
  1.7 本研究的目的和意义  19-20
第二章 大豆耐盐相关基因的克隆和表达分析  20-38
  2.1 试验材料  20-21
    2.1.1 植物材料  20
    2.1.2 主要试剂  20
    2.1.3 序列分析使用网站和软件  20
    2.1.4 试验中使用的引物  20-21
  2.2 试验方法  21-22
    2.2.1 大豆胁迫处理  21
    2.2.2 总 RNA 提取和纯化  21
    2.2.3 反转录  21-22
    2.2.4 RT-PCR  22
    2.2.5 胁迫下表达分析  22
  2.3 结果与分析  22-35
    2.3.1 GmVP 的克隆与分析  22-29
    2.3.2 GmCHR 的克隆与分析  29-32
    2.3.3 GmUsp1 的克隆与分析  32-35
  2.4 讨论  35-38
    2.4.1 GmVP 功能预测  35-36
    2.4.2 GmCHR 功能预测  36
    2.4.3 GmUsp1 功能预测  36-38
第三章 表达载体构建和基因初步功能鉴定  38-57
  3.1 材料  38-40
    3.1.1 植物材料  38
    3.1.2 主要试剂和载体菌株  38
    3.1.3 实验中使用的引物  38-39
    3.1.4 相关培养基配方  39
    3.1.5 主要试剂及配方  39-40
  3.2 方法  40-45
    3.2.1 表达载体构建  40-42
    3.2.2 亚细胞定位  42
    3.2.3 发状根转化  42-43
    3.2.4 发状根 GUS 染色  43
    3.2.5 大豆转基因发状根耐盐性鉴定  43
    3.2.6 离子浓度测定  43-44
    3.2.7 根系 SOD、POD、CAT 活性和 MDA 含量测定  44-45
  3.3 结果与分析  45-55
    3.3.1 GmVP 植物表达载体构建  45-46
    3.3.2 GmCHR 植物表达载体构建  46-47
    3.3.3 GmVP 基因的功能分析  47-53
    3.3.4 GmCHR 基因的功能分析  53-55
  3.4 讨论  55-57
第四章 转 GmPIP 基因的大豆植株的获得和鉴定  57-63
  4.1 材料  57-58
    4.1.1 大豆受体材料  57
    4.1.2 菌株和载体  57
    4.1.3 试剂与耗材  57
    4.1.4 培养基配方  57-58
  4.2 方法  58-60
    4.2.1 根癌农杆菌转化  58-59
    4.2.2 再生植株 PCR 检测  59-60
  4.3 结果与分析  60-63
    4.3.1 GmPIP 基因表达载体构建  60-61
    4.3.2 侵染用根癌农杆菌菌株获得  61
    4.3.3 转 GmPIP 大豆植株的获得和鉴定  61-63
第五章 结论  63-64
参考文献  64-72
致谢  72-73
作者简历  73

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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