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TaBTF3基因在小麦中的克隆及其功能研究

作　者: 马红珍
导　师: 郭天财
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 小麦 TaBTF3 病毒诱导的基因沉默 大麦条纹花叶病毒 生长发育 非生物逆境胁迫
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本文采用cDNA末端快速扩增法（Rapid-amplification of cDNA ends, RACE），在小麦中首次克隆出BTF3基因（命名为TaBTF3）的序列全长，并采用VIGS（Virus-inducedgene silencing, VIGS）技术对其进行基因功能鉴定。主要研究结果如下：1.采用RACE-PCR技术从小麦中首次克隆到TaBTF3基因，其cDNA序列全长882bp，最大ORF序列为534bp，该基因编码一个由177个氨基酸组成的蛋白，预测分子量为20KD。基因组DNA序列全长1742bp，包含5个外显子、4个内含子，内含子和外显子的剪切位点严格符合GT/AC规律。实时定量PCR检测表明，TaBTF3在小麦根、叶、叶鞘、旗叶和幼穗中均有不同程度的表达，在旗叶中表达量最高，且受PEG、冷（4℃）、NaCl、MeJA、ABA和SA诱导上调表达。蛋白亚细胞定位结果表明，TaBTF3蛋白主要定位于细胞核与细胞质。Southern杂交结果显示，TaBTF3是多拷贝基因，以多拷贝的形式存在。2.选用大麦条纹花叶病毒（BSMV）载体，在豫麦34中成功沉默报告基因TaPDS（小麦八氢番茄红素脱氢酶基因），TaPDS-VIGS小麦植株叶片呈现明显的光漂白表型。GFP蛋白荧光检测结果表明，在BSMV-GFP植株的叶片与根系中均可以检测到较强的GFP荧光信号，BSMV诱导的基因沉默是系统性沉默，并不仅仅局限于接种叶片。高效稳定的小麦VIGS技术体系的成功建立，为小麦TaBTF3基因功能分析验证提供了技术平台。3.成功获得TaBTF3-VIGS植株与BSMV-GFP对照植株，并对BSMV-VIGS植株进行鉴定、生理指标检测。沉默TaBTF3基因导致叶绿素含量降低、MDA与H2O2含量显著升高。通过荧光定量PCR检测线粒体、叶绿体编码基因的表达量变化，结果表明，与BSMV-GFP对照植株相比，沉默TaBTF3基因导致线粒体、叶绿体编码基因的表达量显著下降。进一步采用石蜡切片技术观察TaBTF3-VIGS植株叶肉细胞的变化，结果显示，与对照相比，TaBTF3-VIGS植株的叶肉细胞发育异常、体积变小、排列松散、无序、胞间隙较大。由此表明，TaBTF3可能与线粒体、叶绿体和叶肉细胞的生长发育有关。4.通过荧光定量PCR检测小麦逆境相关基因的表达量，并对TaBTF3-VIGS植株与BSMV-GFP对照植株进行胁迫耐受性检测。结果表明，在正常生长条件下，沉默TaBTF3基因导致逆境相关基因的表达被抑制。逆境胁迫处理结果显示，TaBTF3-VIGS植株的相对电导率与失水率显著高于对照，而相对含水量与游离脯氨酸含量则明显降低。沉默TaBTF3降低了小麦植株对干旱和冻害胁迫的耐受性。这些结果表明，TaBTF3参与了植物逆境胁迫耐受性过程。

全文目录


致谢  5-14
摘要  14-15
Abstract  15-17
第一章 文献综述  17-35
  1 河南小麦生产现状与常见自然灾害防御  17-20
    1.1 河南小麦干旱灾害及其防御措施  17
    1.2 河南小麦冻害灾害及其防御措施  17-18
    1.3 植物抗旱基因工程研究进展  18-19
      1.3.1 植物抗旱相关基因研究进展及其调控途径  18-19
    1.4 植物抗冻基因工程研究进展  19-20
      1.4.1 植物抗冻相关基因研究进展及其调控途径  20
  2 转录因子简介  20-22
    2.1 转录因子功能结构域  21-22
  3 BTF3 转录因子基因研究进展  22-23
    3.1 动物和微生物 BTF3 基因研究现状  22
    3.2 高等植物 BTF3 基因研究现状  22-23
  4 VIGS 及其应用  23-25
    4.1 RNAi 及其作用机理  23
    4.2 VIGS 载体的发展  23-24
    4.3 VIGS 载体在植物基因功能研究中的应用  24-25
    4.4 VIGS 技术的优缺点  25
  5 研究目的、意义、内容与技术路线  25-27
    5.1 研究目的与意义  25-26
    5.2 研究内容  26-27
    5.3 技术路线  27
  参考文献  27-35
第二章 小麦 TaBTF3 基因的克隆与分子特性研究  35-54
  摘要  35-36
  Abstract  36
  1 引言  36-37
  2 材料与方法  37-43
    2.1 植物材料及其培养方法  37
      2.1.1 植物材料  37
      2.1.2 植物材料培养方法与胁迫诱导  37
    2.2 菌株与克隆载体  37
    2.3 工具酶和主要化学试剂  37-38
    2.4 培养基及溶液  38
    2.5 主要设备仪器  38-39
    2.6 基因全长 cDNA 序列和基因组 DNA 序列的克隆  39-40
      2.6.1 Total RNA 提取、纯化和检测  39
        2.6.1.1 Total RNA 提取  39
        2.6.1.2 PCR 鉴定 gDNA  39
      2.6.2 RT-PCR 合成 cDNA 第一链  39-40
      2.6.3 Real-time PCR  40
      2.6.4 小麦基因组 DNA 的提取  40
    2.7 引物序列  40-41
    2.8 RACE  41
    2.9 PCR 产物的克隆、鉴定与转化  41-43
      2.9.1 PCR 反应  41
      2.9.2 电泳检测 PCR 产物  41-42
      2.9.3 PCR 产物或 DNA 片段纯化回收  42
      2.9.4 连接反应与转化  42
      2.9.5 质粒抽提  42
      2.9.6 重组克隆的筛选  42-43
        2.9.6.1 菌落/菌液 PCR 初步检测  42
        2.9.6.2 质粒 PCR 与测序鉴定  42-43
    2.10 TaBTF3 的克隆与序列分析  43
  3 结果与分析  43-51
    3.1 TaBTF3 RACE 克隆结果与分析  43-45
    3.2 TaBTF3 ORF、DNA 序列全长的扩增与分析  45-47
    3.3 TaBTF3 同源序列比对和系统进化树的构建  47-48
    3.4 TaBTF3 组织表达特性及其诱导表达特性研究  48-51
  4 讨论  51-52
  参考文献  52-54
第三章 小麦 TaBTF3 基因拷贝数鉴定与亚细胞定位  54-66
  摘要  54
  Abstract  54
  1 引言  54
  2 材料与方法  54-59
    2.1 植物材料及其培养方法  54-55
      2.1.1 植物材料  54
      2.1.2 植物材料培养  54-55
    2.2 亚细胞定位主要材料、试剂和溶液  55-56
      2.2.1 载体和菌株  55
      2.2.2 主要试剂  55
      2.2.3 主要溶液配制  55-56
    2.3 Southern 杂交主要材料、试剂和溶液  56
      2.3.1 主要试剂耗材  56
      2.3.2 主要溶液配制  56
    2.4 引物序列  56-57
    2.5 亚细胞定位实验方法  57-58
      2.5.1 TaBTF3-pJIT163-hGFP 重组载体的构建  57
        2.5.1.1 TaBTF3 基因 ORF 片段的克隆  57
        2.5.1.2 TaBTF3-pJIT163-hGFP 重组载体的构建、转化与筛选  57
      2.5.2 拟南芥原生质体的分离与转化  57-58
    2.6 Southern 杂交实验方法  58-59
      2.6.1 杂交探针的制备、纯化  58
      2.6.2 地高辛标记杂交探针  58
      2.6.3 基因组 DNA 酶切  58
      2.6.4 转膜  58
      2.6.5 杂交  58
      2.6.6 洗膜与显影  58-59
  3 结果与分析  59-64
    3.1 TaBTF3 亚细胞定位结果与分析  59-61
      3.1.1 TaBTF3 亚细胞定位目的基因片段克隆结果  59
      3.1.2 TaBTF3-pJIT163-hGFP 重组载体构建结果与分析  59-60
      3.1.3 TaBTF3 亚细胞定位结果与分析  60-61
    3.2 TaBTF3 Southern 杂交结果与分析  61-64
      3.2.1 Southern 杂交探针序列信息及其扩增结果  61-62
      3.2.2 小麦基因组 DNA 检测结果  62
      3.2.3 地高辛标记探针结果  62-63
      3.2.4 小麦基因组 DNA 酶切结果检测  63
      3.2.5 Southern 杂交结果  63-64
  4 讨论  64-65
  参考文献  65-66
第四章 小麦BSMV-VIGS技术体系的建立  66-84
  摘要  66
  Abstract  66
  1 引言  66-67
  2 材料与方法  67-71
    2.1 植物材料及其培养方法  67
    2.2 菌株与质粒  67
    2.3 工具酶和主要化学试剂  67
    2.4 主要溶液  67-68
    2.5 引物序列  68
    2.6 建立 BSMV-VIGS 技术体系的方法  68-71
      2.6.1 TaPDS 引物设计要求  68-69
      2.6.2 构建 BSMV-TaPDS 重组载体  69
        2.6.2.1 TaPDS 目的基因片段的克隆  69
        2.6.2.2 BSMV-γ: TaPDS 重组载体的构建、转化与筛选  69
      2.6.3 BSMV 载体相关质粒提取  69
      2.6.4 BSMV 载体线性化  69
      2.6.5 体外转录生产病毒  69-70
      2.6.6 小麦材料的准备与接种  70-71
        2.6.6.1 病毒接种混合液的制备  70
        2.6.6.2 小麦材料的准备与接种  70-71
        2.6.6.3 表型分析与转录本水平检测  71
        2.6.6.4 生理指标检测  71
  3 结果与分析  71-80
    3.1 TaPDS 目的基因片段克隆结果分析  71-72
    3.2 BSMV 载体质粒提取结果检测  72-73
    3.3 BSMV-γ:GFP 质粒单酶切结果分析  73
    3.4 BSMV-γ: TaPDS 重组载体鉴定结果分析  73-74
      3.4.1 BSMV-γ: TaPDS-JM109 菌液 PCR 检测结果  73-74
      3.4.2 BSMV-γ: TaPDS 阳性重组质粒酶切鉴定结果  74
    3.5 BSMV 载体线性化结果与分析  74-75
    3.6 体外转录生产 BSMV 病毒产物检测结果  75
    3.7 病毒接种后的表型变化与结果分析  75-79
    3.8 TaPDS 转录本水平表达量变化检测结果  79
    3.9 TaPDS-VIGS 植株 MDA 含量与叶绿素含量测定结果  79
    3.10 TaPDS-VIGS 成功率统计结果  79-80
  4 讨论  80-82
  参考文献  82-84
第五章 小麦 TaBTF3-VIGS 植株的获得与鉴定  84-97
  摘要  84
  Abstract  84
  1 引言  84-85
  2 材料与方法  85-87
    2.1 植物材料及其培养方法  85
    2.2 菌株与质粒  85
    2.3 工具酶和主要化学试剂  85
    2.4 主要溶液  85
    2.5 引物序列  85
    2.6 TaBTF3-VIGS 植株的构建  85-87
      2.6.1 TaBTF3 引物设计  85
      2.6.2 构建 BSMV-TaBTF3 重组载体  85-86
        2.6.2.1 TaBTF3 目的基因片段的克隆  85
        2.6.2.2 BSMV-γ: TaBTF3 重组载体的构建、转化与筛选  85-86
      2.6.3 BSMV 载体相关质粒提取  86
      2.6.4 BSMV 载体线性化  86
      2.6.5 体外转录生产病毒  86
      2.6.6 小麦材料的准备与接种  86
      2.6.7 表型观察与转录本水平检测  86
        2.6.7.1 表型观察  86
        2.6.7.2 转录本水平检测  86
      2.6.8 生理指标检测  86-87
        2.6.8.1 生物量积累检测  86-87
        2.6.8.2 激光共聚焦扫描（confocal）检测 H2O2含量  87
  3 结果与分析  87-95
    3.1 TaBTF3 目的基因片段克隆结果分析  87
    3.2 BSMV-γ: TaBTF3 重组载体鉴定结果分析  87-88
      3.2.1 BSMV-γ: TaBTF3-JM109 菌液 PCR 检测结果  87-88
      3.2.2 BSMV-γ: TaBTF3 阳性重组质粒酶切鉴定结果  88
    3.3 BSMV-γ: TaBTF3 载体线性化结果与分析  88-89
    3.4 体外转录生产 BSMV 病毒产物检测结果  89
    3.5 病毒接种后的表型观察记录结果分析  89-90
    3.6 TaBTF3 转录本水平表达量变化检测结果  90-92
    3.7 BSMV-GFP 植株 GFP 表达检测结果  92
    3.8 TaBTF3-VIGS 植株 MDA 含量与叶绿素含量测定结果  92
    3.9 H_2O2_含量检测  92-93
    3.10 生物量积累比较  93-95
  4 讨论  95
  参考文献  95-97
第六章 TaBTF3 沉默对线粒体、叶绿体和叶肉细胞生长发育的影响  97-103
  摘要  97
  Abstract  97
  1 引言  97
  2 材料与方法  97-99
    2.1 植物材料及其培养方法  97-98
    2.2 主要化学试剂  98
    2.3 主要溶液  98
    2.4 荧光定量 PCR  98
      2.4.1 Total RNA 提取  98
      2.4.2 合成 cDNA 第一链  98
      2.4.3 Real-time PCR 反应  98
    2.5 引物序列  98-99
    2.6 主要实验用具  99
    2.7 主要设备仪器  99
    2.8 石蜡切片方法步骤  99
  3 结果与分析  99-101
    3.1 叶绿体、线粒体相关基因定量 PCR 检测结果  99-100
    3.2 BSMV-VIGS 植株叶片显微观察结果  100-101
  4 讨论  101
  参考文献  101-103
第七章 TaBTF3沉默降低小麦植株非生物胁迫耐受性  103-115
  摘要  103
  Abstract  103
  1 引言  103-104
  2 材料与方法  104-107
    2.1 植物材料与培养方法  104
    2.2 方法  104-107
      2.2.1 植物体内游离脯氨酸含量的测定  104-105
        2.2.1.1 脯氨酸标准曲线的制作  104
        2.2.1.2 样品中脯氨酸含量的测定  104-105
      2.2.2 相对电导率测定  105
        2.2.2.1 实验步骤  105
      2.2.3 离体叶片失水率、相对含水量测定方法  105
      2.2.4 逆境胁迫处理方法  105-106
        2.2.4.1 自然失水干旱胁迫处理  105-106
        2.2.4.2 冻害胁迫处理  106
      2.2.5 逆境相关基因荧光定量 PCR 检测  106-107
        2.2.5.1 定量 PCR 实验方法  106
        2.2.5.2 引物序列  106-107
  3 结果与分析  107-112
    3.1 逆境相关基因定量 PCR 检测结果  107
    3.2 冻害处理过程中游离脯氨酸含量与相对电导率测定结果  107-108
    3.3 TaBTF3-VIGS 植株冻害胁迫耐受性检测结果  108-109
    3.4 离体叶片相对含水量与失水率测定结果  109-110
    3.5 TaBTF3-VIGS 植株干旱胁迫耐受性检测结果  110-112
  4 讨论  112-113
  参考文献  113-115
第八章 结论与展望  115-117
  1 主要结论  115
    1.1 本文首次从小麦中克隆到 BTF3 类转录因子基因 TaBTF3  115
    1.2 成功建立了系统性、稳定沉默的 BSMV-VIGS 技术体系  115
    1.3 沉默 TaBTF3 影响线粒体、叶绿体和叶肉细胞的生长发育  115
    1.4 沉默 TaBTF3 降低了小麦植株对非生物胁迫的耐受能力  115
  2 主要创新点  115-116
  3 后续工作  116-117
附注：已发表论文  117

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