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水稻抗黑条矮缩病毒基因组片段S9的原核表达及其转基因研究

作　者: 应丹平
导　师: 曹明富
学　校: 杭州师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 水稻黑条矮缩病毒 基因组片段S9 转基因水稻 农杆菌介导法 原核表达
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 8次
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内容摘要


水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)隶属呼肠孤病毒科斐济病毒属,其基因组由10条双链RNA组成,按其在PAGE上的迁移率由慢到快,依次为S1-S10。其中RBSDV基因组片段S9长1900nt,为双顺反子,分别编码两个蛋白：P9-1与P9-2。由RBSDV引起的水稻黑条矮缩病严重危害我国水稻生产,造成发病地区水稻减产甚至颗粒无收,但是国内外尚缺乏抗黑条矮缩病毒的水稻品种。本研究根据已报道的序列,设计了RBSDV特异性表达引物,通过PCR扩增了RBSDV的S9-1基因,克隆至载体pGEM-T,并测序鉴定。随后构建了该基因的原核表达载体为pSBET-S9-1。SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导的该原核表达质粒在大肠杆菌BL21plysS中高效表达了P9-1蛋白(36.4kDa)。利用纯化的P9-1蛋白免疫小鼠,制备了P9-1蛋白的抗血清。Western blot分析表明该抗血清具有较高的特异性,与RBSDV病株有强烈的血清学反应。同时,通过设计引物克隆了RBSDV的S9全长基因,将该基因插入到由pBI121和pCAMBIA-1301构建的中间表达载体,经过酶切及PCR等分子鉴定,成功地构建了RBSDV S9基因的植物表达载体,并将其转化到根癌农杆菌EHA105中。随后,通过农杆菌介导法将S9基因转入秀水04水稻品种中,得到了68株转基因水稻。PCR结果表明,在94%的水稻植株中检测到S9基因。挑选20株PCR阳性植株做Southern blot检测,在12株植株中杂交到了条带,这表明S9基因已经成功地整合到水稻基因组中,并且多数S9基因在水稻植株中有单个整合位点。对T1代植株进行PCR和RT-PCR检测结果表明,S9基因已经由T。代稳定遗传到了T1代,并被有效的转录。利用制备的P9-1抗血清对T,代植株进行Western blot检测,都能检测到相应的条带,表明了S9基因在转基因植株中已经成功表达。

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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