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核糖体展示Anticalin模拟抗体库的构建及其在雌二醇、百草枯模拟抗体筛选中的应用

作　者: 刘建青
导　师: 周志江
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 胆汁三烯结合蛋白百草枯雌二醇核糖体展示文库构建
分类号: X171.5
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本论文介绍了核糖体展示（ribosome display）方法用于小分子环境化学污染物模拟抗体（anticalin）筛选的原理、实验技术，并以典型环境化学污染物雌二醇、百草枯为研究对象，对它们的模拟抗体进行了活性鉴定。雌二醇是一种小分子甾体类激素,在组织液及血液中的含量可反应妇产科、内科、内分泌科、骨科及肿瘤等多种疾病,具有广泛的临床应用价值。因其可以提高畜禽瘦肉比并促进动物生长，在畜禽养殖业曾经被广泛应用。但由于雌二醇可在动物组织内形成残留，通过食物链危害人类健康，使男性儿童乳腺发育呈女性化，男性生殖系统发育异常或引起病变，女性儿童提前发育，并导致女性乳腺癌和子宫内膜异位症的发生率上升。因此，对肉及其肉制品中雌二醇的监测是确保广大市民食用“放心肉”的必要措施。百草枯（Paraquat, PQ）又名克芜踪，是一种速效触杀型灭生性季铵盐类除草剂，是我国广泛使用的除草剂之一。百草枯有效成分为1，1′-二甲基-4，4′-联吡啶阳离子盐,它在农作物中的残留对人、兽有毒害作用。百草枯可以经胃肠道、呼吸道和皮肤吸收，以导致肺纤维化。我国国标GB1633321996规定:菜籽油、柑桔、成品粮、梨和苹果中PQ最大允许残留量分别为0.05、0.2、0.5、0.05和0.05mg/kg。利用核糖体展示抗体库库容量大、建库和筛选方法简便的优势，构建Anticalin模拟抗体库。以脂质运载蛋白Lipocalin家族之一：胆汁三烯结合蛋白（bilin-bindingprotein BBP）基因为模板，设计包含16个随机突变位点的引物合成Anticalin模拟抗体库。同时引入核糖体展示必需的全部组件，采用引物重叠PCR技术将Anticalin库与组件进行拼接，从而构建了核糖体展示的Anticalin模拟抗体库。将构建的文库进行体外转录和体外翻译后，以小分子雌二醇、百草枯为靶标，利用固相和液相亲和方法筛选抗雌二醇、百草枯抗体。通过改变Mg²⁺浓度将筛选到的模拟抗体-核糖体-mRNA三联复合体解离，获得模拟抗体所对应的mRNA。通过几轮生物淘筛，抗原阳性的模拟抗体得到富集，获得高特异性抗雌二醇、百草枯抗体。将该抗体序列在大肠杆菌中进行高效表达，经WB印迹验证该蛋白为抗雌二醇抗体、百草枯。因为所用模拟抗体库具有通用性，原理上可以以任意抗原为靶标筛选其模拟的亲和抗体，这为利用核糖体展示技术从模拟抗体库中筛选多种抗原尤其是小分子半抗原的特异性模拟抗体奠定了基础。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
目录  6-9
第一章文献综述  9-23
  1.1 引言  9
  1.2 课题的研究背景  9-21
    1.2.1 典型环境雌激素污染物：雌二醇的概况  9-12
    1.2.2 典型灭生性除草剂：百草枯的概况  12-17
    1.2.3 核糖体展示技术的研究进展  17
    1.2.4 核糖体展示技术的原理  17-18
    1.2.5 核糖体展示的优势  18-19
    1.2.6 核糖体展示在模拟抗体 Anticalin 制备过程中的应用  19-21
  1.3 国内外研究现状  21-22
    1.3.1 Anticalin 制备技术的研究进展  21
    1.3.2 核糖体展示技术适合从突变库中筛选特异模拟抗体  21-22
  1.4 研究的目的和意义  22-23
第二章 Anticalin 库的构建与质量鉴定  23-53
  2.1 引言  23
  2.2 材料与方法  23-41
    2.2.1 材料  23-25
    2.2.2 方法  25-41
  2.3 结果与分析  41-50
    2.3.1 bbp 基因库的分段合成  41-44
    2.3.2 Anticalin 模拟抗体库的合成  44-46
    2.3.3 bbp 基因库序列正确性的鉴定  46-47
    2.3.4 bbp 基因库测序结果  47-49
    2.3.5 Anticalin 模拟抗体库容量  49
    2.3.6 Anticalin 转录活性的鉴定  49
    2.3.7 Anticalin 反转录活性的鉴定  49-50
  2.4 讨论  50-53
    2.4.1 Lipocalin 随机突变位点的引入  50-51
    2.4.2 核糖体展示元件的的连接  51
    2.4.3 Anticalin 文库的质量鉴定  51-53
第三章雌二醇全抗原的合成与模拟抗体的筛选  53-76
  3.1 引言  53
  3.2 实验材料与方法  53-64
    3.2.1 实验材料  53-55
    3.2.2 方法  55-64
  3.3 结果与分析  64-74
    3.3.1 雌二醇半抗原和完全抗原的鉴定  64-69
    3.3.2 雌二醇模拟抗体的体外筛选  69-74
  3.4 讨论  74-76
    3.4.1 雌二醇完全抗原的合成  74
    3.4.2 雌二醇模拟抗体的固相筛选  74-76
第四章雌二醇模拟抗体的性质鉴定  76-96
  4.1 引言  76
  4.2 材料与方法  76-85
    4.2.1 材料  76-79
    4.2.2 方法  79-85
  4.3 结果与分析  85-93
    4.3.1 pTIG-TRX-bbp 阳性克隆子验证  85-86
    4.3.2 pTIG-TRX-bbp 的诱导表达  86
    4.3.3 雌二醇模拟抗体的纯化  86-87
    4.3.4 雌二醇模拟抗体的 Western Blot 检测  87
    4.3.5 雌二醇模拟抗体结合活性的检测  87-88
    4.3.6 雌二醇模拟抗体竞争活性的检测  88-89
    4.3.7 雌二醇模拟抗体特异性检测  89-90
    4.3.8 雌二醇模拟抗体的序列比对  90-91
    4.3.9 非还原 SDS-PAGE 分析模拟抗体 E_2-A 的折叠情况  91-92
    4.3.10 SPR 分析模拟抗体 E_2-A 的亲和力  92-93
  4.4 讨论  93-96
    4.4.1 模拟抗体的表达  93-94
    4.4.2 模拟抗体的纯化  94
    4.4.3 模拟抗体的活性鉴定  94-96
第五章百草枯完全抗原的合成与模拟抗体的筛选  96-114
  5.1 引言  96
  5.2 实验材料与方法  96-103
    5.2.1 实验材料  96-97
    5.2.2 方法  97-103
  5.3 结果与分析  103-112
    5.3.1 百草枯半抗原和完全抗原的鉴定  103-108
    5.3.2 百草枯模拟抗体的体外筛选  108-112
  5.4 讨论  112-114
    5.4.1 百草枯完全抗原的合成  112
    5.4.2 百草枯模拟抗体的固相筛选  112-114
第六章百草枯模拟抗体的性质鉴定  114-123
  6.1 引言  114
  6.2 材料与方法  114-117
    6.2.1 材料  114-115
    6.2.2 方法  115-117
  6.3 结果与分析  117-122
    6.3.1 pTIG-TRX-bbp 阳性克隆子验证  117-118
    6.3.2 pTIG-TRX-bbp 的诱导表达  118-119
    6.3.3 百草枯模拟抗体的纯化  119
    6.3.4 百草枯模拟抗体的 Western Blot 检测  119-120
    6.3.5 百草枯模拟抗体结合活性的检测  120-121
    6.3.6 百草枯模拟抗体竞争活性的检测  121
    6.3.7 SPR 分析模拟抗体 PQ-1 的亲和力  121-122
  6.4 讨论  122-123
结论  123-124
展望  124-125
参考文献  125-130
致谢  130-131
附录  131-132
英文缩略  132-133
发表论文和参加科研情况说明  133

核糖体展示Anticalin模拟抗体库的构建及其在雌二醇、百草枯模拟抗体筛选中的应用

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