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谷胱甘肽合成相关酶在重金属污染生物修复中的分子机制及比较研究

作　者: 刘大丽
导　师: 毛子军
学　校: 东北林业大学
专　业: 植物学
关键词: 重金属逆境生物修复谷胱甘肽合成相关酶转基因重金属富集
分类号: X171.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着社会经济和工业的发展,重金属污染成为全球范围内关注的环境问题。这种污染不仅会影响动植物生长发育、导致农产品质量下降,并且通过食物链直接威胁人类身体健康。因而,解决重金属污染问题迫在眉睫。生物修复（Bioremediation）技术由于其高效、经济、绿色、清洁、环保等特点,作为污染生态学的一个重要课题,在重金属污染治理中逐渐引起人们的关注。天然存在的具备重金属生物修复作用的微生物和超累积植物等往往由于它们在重金属逆境中的生长缓慢、生物量小等弊端,常常会影响生物修复的效率。本研究采用基因工程遗传转化、培养基模拟、转基因抗性微生物及植物筛选等技术手段,针对利用谷胱甘肽合成相关酶来提高大肠杆菌和能源甜菜生物修复重金属污染效果展开实验,系统地摸索了三种谷胱甘肽合成关键酶的重金属逆境中的响应机制,以及它们在转基因大肠杆菌、拟南芥和能源甜菜体内的表达特性；比较研究了三种基因型的重组大肠杆菌和转基因植物在重金属逆境下的表现型、生理生化差异及对重金属Cd、Zn、Cu的吸收规律；比较验证了这三种谷胱甘肽合成相关酶对提高大肠杆菌微生物、拟南芥、能源甜菜的重金属耐受性和重金属离子生物富集量的作用；初步探索了重组大肠杆菌和重金属耐性转基因植物在重金属生物修复方面的作用,从而为生物修复品种的开发提供了新思路。本研究的主要内容包括以下几方面：1.利用RT-PCR技术,本研究分别克隆了拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）中编码谷胱甘肽合成酶的γ-GCS和GS的AtGCS （Genbank accession no. NM₁18439）、AtGS （Genbank accession no. NM₁22620）基因以及嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）中编码谷胱甘肽合成酶StECS-GS的StECS-GS （Genbank accession no. GQ848551）基因。这三个基因CDS全长分别为1569bp、1620bp、2265bp；所编码蛋白的分子量分别为58.56kDa、60.27kDa、85.12kDa;等电点分别为6.52、6.45和4.9；根据PSORT软件预测,三个蛋白在植物体内分别有56%、94%和45%的可能性位于过氧化物酶体、叶绿体膜以及细胞质中；同时在AtGCS和AtGS的5’非翻译区域存在着与干旱等环境逆境相关的顺式作用元件,说明它们可能与环境逆境之间存在着一定的应答关系。2.系统地比较研究了拟南芥AtGCS和AtGS基因在Cd、Zn、Cu重金属逆境下的转录表达特性。研究结果表明这两个基因均在转录水平上受到200μM Cd2+、Zn2+、Cu2+重金属逆境的诱导,并且与对照相比,它们在拟南芥地上部和地下部中表达量均有所增加。但在不同处理时间下受重金属逆境胁迫的影响,AtGCS和AtGS基因的表达量也出现了一定的变化和差异。在Cd逆境中,拟南芥地上部AtGS的诱导表达比较突出,而在地下部,AtGCS的诱导表达更明显一些；在Zn和Cu逆境下,AtGCS对前者的响应更加明显一些,AtGS则对后者更为敏感；在重金属方面,Cd对两个基因的诱导表达量的增幅最大,并且在Cd逆境下,两个基因在地上部的表达量要高于地下部,Zn和Cu逆境在这方面的差异不大。这说明拟南芥AtGCS和AtGS基因与重金属环境逆境之间存在着一定的应答关系,并且它们可能分别不同程度地参与到了拟南芥的抗重金属生理活动中。3.利用大肠杆菌外源蛋白重组技术,系统地比较了分别大量表达重组蛋白TrxA-AtGCS、TrxA-AtGS、TrxA-StECS-GS的重组大肠杆菌,在1mM CdCl2、ZnCl2、CuCl2重金属胁迫下的重金属耐受性和重金属离子富集能力。研究结果表明,过量表达TrxA的对照菌株在1mM重金属逆境下生长受到了严重的抑制,而过量表达TrxA-StECS-GS的E. coli对重金属逆境的耐受性最强,并且在提高细胞的存活率方面表现出StECS-GS>AtGCS> AtGS的趋势；同时,在重金属逆境下,重组菌的重金属富集能力也与对照相比具有明显的优势：过量表达TrxA-StECS-GS的E. coli对Cd、Zn、Cu的富集量分别是对照的15倍、8倍、9倍左右；TrxA-AtGCS过量表达细胞提高了10倍、5倍、7倍的大肠杆菌对重金属离子富集量；而过量表达TrxA-AtGS的大肠杆菌稍差一些,分别是对照的5、4、5倍左右。重组菌体内的GSH含量趋势（TrxA-StECS-GS>TrxA-AtGCS>TrxA-AtGS> TrxA）可以解释这种重金属高富集量的现象和差异。同时,研究将另外两种在重金属抗性机制中发挥重要作用的功能蛋白OsHSP90和OsCATb作为对比研究,结果发现过量表达GST-OsHSP90和GST-OsCATb的重组大肠杆菌尽管在生长势方面比过量表达GST的对照菌株高,并介于TrxA-AtGCS和TrxA-AtGS之间,但是它们的重金属富集能力和体内GSH含量却没有明显提升。这说明谷胱甘肽合成相关酶、分子伴侣和抗氧化酶在重金属抗性机制方面有所不同,并且在行使重金属污染生物修复功能方面,谷胱甘肽合成相关酶具有更加明显的优势。其中,StECS-GS的作用最为突出。4.利用转基因技术,将AtGCS、AtGS以及StECS-GS基因遗传转化到模式植物拟南芥中,以比较研究它们在植物体内的重金属耐受能力和在重金属生物修复中的潜力和分子机制。研究结果表明,在正常生长条件下,分别过量表达AtGCS、AtGS以及StECS-GS目的基因的转基因拟南芥株系（gcs2、gs2和ecs-gs4）和野生型（wt）在生长状态上没有明显差异；而随着CdCl2、ZnCl2、CuCl2的重金属浓度的增加,wt的生长受到了严重的抑制,并在根长及鲜重方面仅为ecs-gs4的1/4-1/3左右；过量表达AtGCS、AtGS以及StECS-GS的转基因拟南芥植株在Cd和Cu中均不同程度的提高了重金属耐受性,其中StECS-GS的作用最大；而在Zn逆境下,只有StECS-GS转基因植株表现出重金属耐受性的提高。在重金属离子富集量方面,总体表现出转基因植株地上部的重金属累积量高于地下部,转基因植株之间表现出StECS-GS基因型AtGCS、AtGS基因型>野生型累积趋势,并且ecs-gs4对Cd的富集量最高,是对照的4.5倍以上,Zn和Cu稍低一些。而在GSH和PC的含量上,总体趋势也同样呈现出类似的现象,并且随着逆境的施加,GSH在总体水平上下降,而PC含量上升。以上结果表明了三个谷胱甘肽合成关键酶在重金属逆境下是通过自身的过量表达解除相应的反馈抑制从而大量催化合成了GSH和PC,而GSH和PC可以大量螯合重金属离子,并具备抗氧化功能,因而使得转基因拟南芥可以表现出对重金属离子的高度富集和耐受性。而StECS-GS因其具备的双重谷胱甘肽合成酶功能,在抗重金属逆境方面的独特优势使其成为利用基因工程培育人工超累积植物的优势基因,在重金属植物修复中具有潜在的优势。5.以上述研究为基础,以可以生产生物燃料乙醇的能源甜菜为生物修复基础材料,通过模拟实验研究了StECS-GS基因在提高转基因甜菜对单一或复合重金属Cd、Zn、Cu污染的耐受性和生物富集量方面的作用,初步探讨了该基因在能源甜菜体内的重金属响应机制和规律。研究结果表明过量表达StECS-GS基因的转基因甜菜（s2、s4、s5）,在不同浓度（50、100、200μM Cd、Zn、Cu）重金属逆境胁迫下,它们与对照植株wt相比均表现出明显的生长优势,并且在鲜重和根长方面得以具体体现；这种生长优势基本上与StECS-GS基因的表达量成正比。同时,在植株叶片叶绿素含量方面,重金属逆境下转基因植株体内的含量也比野生型植株有所提升,但转基因植株之间差异不大。在100μM重金属离子强度下,转基因植株s2、s4、s5地上部（Shoot）中的Cd、Zn、Cu的重金属累积量分别是对照甜菜的5倍至4倍左右,并且表现出s2>s4>s5>wt的趋势；在根中,转基因植株s2重金属的累积量要小于s4、s5,但却是对照植株2-3倍左右。总体来说,转基因植株地上部重金属离子的累积量是地下部的三倍以上,甚至更多。这说明在转基因甜菜体内对于重金属离子的累积主要集中在地上部。在正常生长条件下,转基因植株s2、s4和s5体内GSH的含量分别是wt对照甜菜的5倍、4倍和3.8倍左右,这说明StECS-GS的过量表达催化合成了大量的GSH；而在Cd、Zn、Cu胁迫下,s2、s4、s5和wt体内的GSH含量有所下降,PC含量上升,转基因植株体内的GSH和PC含量始终高于对照。因而,转基因植株所表现的高重金属耐受性和高重金属离子富集能力的现象基本可以解释为GSH一部分用于合成PC并与其一起螯合重金属离子,另一部分可能在抗重金属氧化胁迫中发挥重要作用。在双重Cd-Zn、Cd-Cu、Zn-Cu和多重Cd-Zn-Cu复合重金属胁迫条件下,转StECS-GS基因植株无论在表现型、生物量还是重金属富集能力方面,都比对照甜菜具有明显的优势,并且金属离子以加成的方式被富集在转基因甜菜体内。这说明过量表达StECS-GS基因的甜菜植株在重金属耐受性、生物量、重金属离子非特异性和富集量方面都具备了重金属污染植物修复的特质和潜力,具有极大的开发价值。

全文目录

摘要  3-6
Abstract  6-18
1 绪论  18-40
  1.1 重金属污染来源、现状及危害  18-21
    1.1.1 重金属污染来源  18-19
    1.1.2 重金属污染的现状  19-20
    1.1.3 重金属污染的危害  20-21
  1.2 重金属污染的治理方法及机理  21
  1.3 重金属污染的生物修复  21-26
    1.3.1 微生物修复  22-23
    1.3.2 植物修复  23-25
    1.3.3 植物-微生物联合修复  25
    1.3.4 基因工程在生物修复中的应用  25-26
  1.4 重金属逆境胁迫  26-31
    1.4.1 重金属逆境对微生物的影响及其调控机制  26-28
    1.4.2 植物对重金属逆境的响应及其调控机制  28-31
  1.5 谷胱甘肽及其合成酶的研究进展  31-35
    1.5.1 谷胱甘肽(GSH)的合成及调控  31
    1.5.2 谷胱甘肽介导的植物重金属耐受性机制  31-33
    1.5.3 通过谷胱甘肽相关基因遗传操作来提高植物重金属耐性  33-34
    1.5.4 谷胱甘肽合成酶的研究进展  34-35
  1.6 能源甜菜及其重金属生物修复潜力  35-37
    1.6.1 能源植物种类  35-36
    1.6.2 我国能源植物开发利用的现状及所面临的问题  36
    1.6.3 能源甜菜的研究现状  36-37
  1.7 本研究目的意义  37-40
2 StECS-GS和AtGCS、AtGS基因的克隆及重金属逆境胁迫下的表达特性分析  40-54
  2.1 材料和方法  41-45
    2.1.1 植物材料及逆境处理  41
    2.1.2 实验试剂、载体、菌株及培养基  41
    2.1.3 拟南芥总RNA的提取  41-42
    2.1.4 拟南芥AtGCS和AtGS基因的克隆  42-44
    2.1.5 嗜热链球菌StECS-GS基因的克隆  44-45
    2.1.6 AtGCS、AtGS及StECS-GS基因的生物信息学分析  45
    2.1.7 重金属逆境胁迫下拟南芥AtGCS、AtGS基因的转录表达特性  45
  2.2 结果与分析  45-52
    2.2.1 拟南芥AtGCS、AtGS及嗜热链球菌StECS-GS基因的克隆  45-48
    2.2.2 拟南芥AtGCS、AtGS和嗜热链球菌StECS-GS基因序列分析  48-49
    2.2.3 重金属逆境胁迫下Arabidopsis AtGCS、AtGS基因表达特性的研究  49-52
  2.3 本章小结  52-54
3 过量表达AtGCS、AtGS及StECS-GS大肠杆菌的重金属耐受性分子机制及生物修复功能研究  54-78
  3.1 材料和方法  55-65
    3.1.1 菌株、表达载体和培养基  55
    3.1.2 分子生物学常用试剂  55
    3.1.3 蛋白相关缓冲液  55-56
    3.1.4 pETM-20-StECS-GS、AtGCS及AtGS原核表达载体的构建及转化  56-60
    3.1.5 pETM-20::rage重组质粒的构建  60-61
    3.1.6 大肠杆菌BL21感受态的制备与转化  61-62
    3.1.7 融合蛋白的表达与纯化  62-63
    3.1.8 SDS-PAGE电泳、染色及脱色  63-64
    3.1.9 重组大肠杆菌的重金属耐受性分析  64
    3.1.10 重金属富集分析及细胞谷胱甘肽浓度测定  64-65
    3.1.11 数据分析  65
  3.2 结果与分析  65-76
    3.2.1 大肠杆菌表达载体pETM-20-AtGCS、AtGS、StECS-GS重组质粒的构建及鉴定  65-68
    3.2.2 TrxA-AtGCS、AtGS、StECS-GS融合蛋白在BL21中的表达与纯化  68-69
    3.2.3 过量表达TrxA-AtGCS、AtGS、StECS-GS重组大肠杆菌的重金属耐受性  69-71
    3.2.4 过量表达TrxA-AtGCS、AtGS、StECS-GS的重组大肠杆菌的重金属生物富集能力及细胞GSH水平  71-72
    3.2.5 其它重金属抗性相关蛋白在重金属生物修复的分子机制中的对比研究  72-76
  3.3 本章小结  76-78
4 转StECS-GS和AtGCS、AtGS基因拟南芥在重金属逆境生物修复分子机制中的比较研究  78-101
  4.1 材料和方法  78-85
    4.1.1 植物材料及逆境处理  78-79
    4.1.2 实验试剂及培养基  79
    4.1.3 pENTR/SD/D-TOPO-AtGCS、AtGS、StECS-GS入门载体构建  79-81
    4.1.4 pGWB2-AtGCS、AtGS、StECS-GS植物表达载体构建  81-83
    4.1.5 拟南芥的遗传转化Agrobacterium-mediated dip flora transfomation  83
    4.1.6 转基因拟南芥植株的分子鉴定  83-84
    4.1.7 转基因拟南芥植株的重金属耐受性分析  84
    4.1.8 重金属含量测定  84-85
    4.1.9 谷胱甘肽及植物螯合素含量测定  85
    4.1.10 数据分析  85
  4.2 结果与分析  85-99
    4.2.1 入门载体pENTR/SD/D-TOPO-AtGCS、AtGS、StECS-GS的构建  85-88
    4.2.2 植物表达载体pGWB2-AtGCS、AtGS、StECS-GS的构建及鉴定  88-91
    4.2.3 拟南芥的遗传转化及转基因植株的分子鉴定  91-92
    4.2.4 转基因拟南芥植株的重金属耐受性分析及比较研究  92-96
    4.2.5 AtGCS、AtGS、StECS-GS转基因拟南芥植株对重金属富集能力的比较研究  96-97
    4.2.6 AtGCS、AtGS、StECS-GS转基因植株的GSH和PC含量的比较研究  97-99
  4.3 本章小结  99-101
5 利用StECS-GS转基因能源甜菜进行重金属逆境生物修复的初探  101-116
  5.1 材料和方法  101-103
    5.1.1 植物材料及逆境处理  101-102
    5.1.2 实验试剂  102
    5.1.3 甜菜转基因植株的遗传转化  102
    5.1.4 转基因甜菜植株的分子鉴定  102
    5.1.5 转基因甜菜植株的重金属胁迫下的表型分析  102-103
    5.1.6 转基因植株叶绿素总含量测定  103
    5.1.7 甜菜植株体内重金属、GSH和PC含量测定  103
    5.1.8 数据分析  103
  5.2 结果与分析  103-114
    5.2.1 StECS-GS基因对甜菜的遗传转化  103-104
    5.2.2 转基因StECS-GS甜菜植株的分子鉴定  104-105
    5.2.3 转基因StECS-GS甜菜植株的重金属耐受性分析  105-106
    5.2.4 转基因StECS-GS甜菜植株在重金属逆境下的根长和鲜重分析  106-108
    5.2.5 转基因StECS-GS甜菜植株的叶绿素含量分析  108-109
    5.2.6 转基因StECS-GS甜菜植株重金属生物富集量分析  109-110
    5.2.7 转基因StECS-GS甜菜植株体内GSH和PC含量分析  110-111
    5.2.8 复合重金属污染条件下,转基因StECS-GS甜菜的重金属耐受性分析及重金属富集量测定  111-114
  5.3 本章小结  114-116
结论  116-120
参考文献  120-140
附录  140-143
攻读学位期间发表的学术论文  143-144
致谢  144-145

谷胱甘肽合成相关酶在重金属污染生物修复中的分子机制及比较研究

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