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软骨藻酸分子毒理学机制及紫甘薯花青素神经保护机制研究

作　者: 吴冬梅
导　师: 张雁秋
学　校: 中国矿业大学
专　业: 环境工程
关键词: 软骨藻酸紫甘薯花青素神经毒性线粒体损伤内质网应激
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

拟菱形藻是现今发现的可引发有毒赤潮的唯一硅藻种属，其产生的软骨藻酸（domoic acid, DA）是一种记忆缺失性贝毒，并发现长期存在于海洋生物链中，为了降低软骨藻酸对海洋生态环境的危害及对人类健康的影响，本论文成功建立了软骨藻酸小鼠慢性染毒模型，研究其神经毒性和作用机制，并进一步采用紫甘薯花青素（purple sweet potato color, PSPC）处理改善小鼠学习记忆能力，研究其对软骨藻酸慢性染毒小鼠脑部海马区的保护机制，以期为软骨藻酸解毒药的研制提供重要的依据。实验主要分为以下几部分：一、海洋藻毒素软骨藻酸对小鼠的行为毒理学研究及紫甘薯花青素的干预效果研究避暗法实验和Morris水迷宫实验结果发现软骨藻酸显著降低小鼠学习记忆能力，进一步采用NeuN荧光免疫组化技术检测，结果显示软骨藻酸能显著引起小鼠脑部尤其是海马区神经元丢失。Western blot检测发现学习记忆相关蛋白NR1，NR2A和PSD95的表达均显著下降，这也是软骨藻酸小鼠认知损伤发生的分子生物学基础。研究发现紫甘薯花青素能显著提高软骨藻酸染毒小鼠学习记忆相关蛋白的表达，抑制海马区神经元丢失，从而有效改善小鼠学习记忆能力。二、软骨藻酸致小鼠神经毒作用的线粒体损伤机制研究及紫甘薯花青素的保护作用线粒体活性研究发现软骨藻酸能引起小鼠海马神经元线粒体氧化呼吸链功能下降，ATP消耗显著增加，并且能显著降低PGC-1α的表达，从而抑制线粒体增殖通路，导致电子传递链复合物ComplexI-V的表达水平显著下降，最终诱导线粒体功能发生紊乱。本实验成功建立ERα siRNA小鼠模型，发现紫甘薯花青素能通过上调ERα的表达，激活软骨藻酸小鼠线粒体增殖通路，提高ComplexI-V的表达，从而有效维持线粒体的正常功能，发挥神经保护作用。三、软骨藻酸致小鼠神经毒作用的氧化应激分子机制研究及紫甘薯花青素的保护作用软骨藻酸小鼠海马组织Reactive Oxygen Species (ROS)和蛋白羰基化水平均显著提高，引起组织氧化应激的发生。除了线粒体功能紊乱导致ROS的过量产生外，软骨藻酸还能显著上调NADPH氧化酶p47phox和gp91phox的表达加重神经组织氧化应激损伤。而紫甘薯花青素能显著降低ROS和蛋白羰基化水平，此外还可以通过抑制p47phox和gp91phox的表达减轻软骨藻酸小鼠海马区神经元的氧化应激。四、软骨藻酸致小鼠神经毒作用的内质网损伤机制研究及紫甘薯花青素的保护作用采用western blot和免疫共沉淀方法研究表明软骨藻酸能显著提高内质网应激（ER stress）标志分子Grp78的表达，激活分别由PERK和IRE1所介导的信号通路，引起ER stress的发生。紫甘薯花青素能有效阻断这两条信号通路的激活，并在一定程度上激活ERα介导的信号通路，改善线粒体功能，减少ROS的产生，抑制ER stress的发生。五、软骨藻酸致小鼠神经毒作用的细胞凋亡机制研究及紫甘薯花青素的保护作用采用western blot和TUNEL染色方法研究发现，软骨藻酸能引起小鼠海马组织凋亡的发生，进一步采用ER stress抑制剂PBA研究ER stress在神经元凋亡过程中的作用机制发现，软骨藻酸激活了分别由caspase-12，CHOP和JNK介导的三条内质网凋亡通路，诱导凋亡的发生。紫甘薯花青素能有效抑制软骨藻酸诱导的神经元凋亡。而ERα的沉默能抑制紫甘薯花青素的抗凋亡作用，结合上述实验结果可推测出紫甘薯花青素能够通过激活ERα介导的线粒体增殖通路抑制软骨藻酸引起的ER stress有效抑制神经元凋亡。综上所述，本论文对可引起有毒赤潮的拟菱形藻产生的毒素软骨藻酸的神经毒作用机制进行了深入全面的研究，其毒性作用严重危害了人类和海洋动物的健康，同时通过紫甘薯花青素处理有效减轻了软骨藻酸的毒性作用，为软骨藻酸的防治提供了新的思路，同时也在一定程度上为有效控制其对海洋生态环境的危害作用提供理论基础。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-10
Extended Abstract  10-13
目录  13-17
图清单  17-20
缩略词表  20-22
1 绪论  22-46
  1.1 概述  22-29
  1.2 软骨藻酸神经毒作用的分子机制  29-39
  1.3 紫甘薯花青素  39-42
  1.4 研究内容与技术路线  42-46
2 小干扰 RNA 沉默 ERα基因表达及紫甘薯花青素处理的剂量选择  46-59
  2.1 概述  46
  2.2 实验材料与方法  46-51
  2.3 实验结果  51-57
  2.4 讨论  57-59
3 软骨藻酸慢性染毒小鼠行为毒理学及紫甘薯花青素改善小鼠学习记忆能力的研究  59-70
  3.1 概述  59
  3.2 实验材料与方法  59-62
  3.3 实验结果  62-68
  3.4 讨论  68-70
4 软骨藻酸致小鼠神经毒作用的线粒体损伤机制研究及紫甘薯花青素的保护作用  70-81
  4.1 概述  70
  4.2 实验材料与方法  70-72
  4.3 实验结果  72-79
  4.4 讨论  79-81
5 软骨藻酸致小鼠神经毒作用的氧化应激分子机制研究及紫甘薯花青素的保护作用  81-90
  5.1 概述  81
  5.2 实验材料与方法  81-84
  5.3 实验结果  84-88
  5.4 讨论  88-90
6 软骨藻酸致小鼠神经毒作用的内质网损伤机制研究及紫甘薯花青素的保护作用  90-97
  6.1 概述  90
  6.2 实验材料与方法  90-91
  6.3 实验结果  91-96
  6.4 讨论  96-97
7 软骨藻酸致小鼠神经毒作用的细胞凋亡机制研究及紫甘薯花青素的保护作用  97-107
  7.1 概述  97
  7.2 实验材料与方法  97-99
  7.3 实验结果  99-105
  7.4 讨论  105-107
8 结论  107-109
  8.1 主要结论  107-108
  8.2 创新点  108-109
参考文献  109-124
作者简历  124-126
学位论文数据集  126

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