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利用纳米金探针检测p53蛋白

作　者: 黄云艳
导　师: 赵林川；贾春平
学　校: 苏州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 纳米金纳米金探针磁珠探针蛋白芯片
分类号: R730.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

肿瘤标志物检测是肿瘤普查、诊断和预后的主要技术手段之一。p53蛋白是最常用的主要肿瘤标志物之一。目前主要通过免疫组织化学法(IHC)或酶联免疫反应(ELISA)方法检测血清中p53抗体的含量,以进行肿瘤普查、诊断和预后。由于血清p53蛋白含量极低,目前还不能利用上述方法测定p53蛋白。在本项研究中,首先利用标记了p53捕捉抗体的纳米磁珠来富集并且分离血清中的p53蛋白,然后利用标记了p53检测抗体和HRP (horseradish peroxidase)的纳米金探针检测已经富集的p53蛋白。此外,本研究还探讨了结合使用蛋白芯片和纳米金探针技术来检测多种肿瘤标志物的可能,以建立集样品制备、生化反应到分析检测于一体的微型全分析系统,从而同时对一个样本进行多种蛋白检测分析。1标记p53捕捉抗体后纳米磁珠表征荧光显微镜观察表明,p53抗体已成功标记到纳米磁珠颗粒表面,并且纳米磁珠表面的p53抗体与p53蛋白结合能力良好。透射电子显微镜(TEM)扫描结果进一步表明,p53抗体—纳米磁珠外观为球形、粒径分布均匀、分散性良好、具有较强的磁响应性。2纳米金探针制备利用柠檬酸三钠还原法制备的纳米金。TEM检测结果表明,所制备的纳米金颗粒分散性良好、大小均匀,粒径约10 nm。进一步标记p53捕捉抗体和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)后,纳米金颗粒周围有一圈清晰可见的―晕‖环,与未标记的纳米金颗粒周围清晰的界面成鲜明对比。纳米金的紫外—可见光谱最大吸收峰从520 nm转移到524 nm(IgG-Au-HRP探针)和526 nm(IgG-Au-DNA-HRP探针)。上述结果表明,纳米金、p53捕捉抗体和HRP形成了复合物。3纳米金探针制备条件优化根据制备溶液pH和p53检测抗体用量对纳米金探针稳定性和检测灵敏度的影响,我们确定最适pH值为9.0, 100 ?L纳米金溶液中适宜加入0.25 ?L检测抗体。通过p53蛋白检测效果对IgG-Au-HRP和IgG-Au-DNA-HRP探针制备条件进行进一步优化。结果表明,在制备IgG-Au-HRP探针时,HRP分子和p53抗体的最佳比例为10:1;在制备IgG-Au-DNA-HRP探针时,DNA和p53抗体的最佳比例为2.5: 1。HRP分子定量检测显示,一个IgG-Au-HRP探针可标记HRP数量约11个,IgG-Au-DNA-HRP探针可标记HRP数量为20个。4利用磁珠探针和纳米金探针检测p53蛋白样品中p53蛋白(抗原)分别与磁珠探针的捕捉抗体和纳米金探针的检测抗体发生免疫结合反应形成―三明治‖夹心结构,通过检测HRP活性变化来定量检测样品p53蛋白含量。该检测过程可以在2 h里完成。灵敏度分别为0.03 ng/mL( IgG-Au-DNA-HRP )和0.055 ng/mL ( IgG-Au-HRP),都显著优于ELISA的检测灵敏度。5纳米金探针结合蛋白芯片检测p53、CEA、NSE蛋白待测p53、癌胚抗原(carc inoembryonic antigen, CEA)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)分别与蛋白芯片表面的各自捕捉抗体特异结合,再与加入纳米金探针表面的检测抗体特异结合,完成对样品中抗原-抗体复合物染色。最后应用芯片扫描仪对光学信号的灰度值进行分析,进行多蛋白含量检测。结果表明该方法可应用于多种蛋白联合检测。以上研究结果表明:根据纳米金探针和磁珠探针技术提出的p53蛋白检测方法,具有操作过程简单、灵敏度高、重复性好等优点。该法在临床微量蛋白检测中具有重要的应用价值;此外,纳米金探针可结合蛋白芯片技术,可以同时检测一个样本中的多种蛋白,为肿瘤标志物联合检测提供了新的检测方法。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-12
第一部分文献综述  12-26
  第一章肿瘤相关蛋白-p53 蛋白  12-15
    1. 肿瘤标志物  12-13
    2. p53 蛋白  13-15
  第二章 p53 蛋白检测  15-17
    1. 免疫组织化学法  15
    2. 放射免疫测定法  15
    3. 酶免疫分析  15-16
    4. 组织微阵列技术  16-17
  第三章纳米技术在临床检测中的应用  17-26
    1. 纳米金探针研究  17-21
    2. 纳米生物芯片  21-22
    3. 免疫磁珠研究  22-24
    4. 技术路线  24-26
第二部分实验研究  26-54
  第四章实验材料与方法  26-35
    1. 材料  26-28
    2. 实验方法  28-35
  第五章结果与分析  35-50
    1. 磁珠探针的标记与表征  35-36
    2. 纳米金及纳米金探针溶液表征  36-41
    3. 利用IgG-Au-HRP 探针和磁珠探针检测p53 蛋白  41-45
    4. 利用IgG-Au-DNA-HRP 纳米金探针和磁珠探针检测p53 蛋白  45-48
    5. 纳米金探针结合蛋白芯片检测p53 蛋白  48-50
  第六章讨论与结论  50-54
    1. 纳米金及纳米金探针  50-52
    2. 应用纳米金探针和磁珠探针检测p53 蛋白  52-53
    3. 纳米金探针结合蛋白芯片检测p53 蛋白  53-54
参考文献  54-61
研究生期间发表文章  61-62
附录主要缩略语  62-63
致谢  63-64

利用纳米金探针检测p53蛋白

内容摘要

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