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荧光碳点的制备及其在药物分析中的应用

作　者: 刘慧
导　师: 黄承志
学　校: 西南大学
专　业: 分析化学
关键词: 碳点生物相容性小檗碱类药根碱乙酰半胱氨酸
分类号: R917
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

碳点(Carbon Dots, CDs)作为新型荧光碳纳米材料,具有类似量子点优良的光致发光性能,同时具有化学惰性和良好的生物相容性。因此,·碳点是潜在的可以替代量子点的良好选择。然而,碳点的制备与应用还有一定的挑战,主要体现在以下两方面：(1)高荧光量子产率的碳点,其发射光颜色大多为蓝色或绿色,与生物体的背景荧光相近,不利于成像研究；而发射光为红色的碳点,其荧光量子产率都较低。(2)由于碳点表面基团的不确定性和缺乏多样性,其应用依然受到限制。因此,如何充分利用荧光碳点的优良性质,将其应用在更多的领域还需进一步研究。本文主要从荧光碳点的制备出发,研究了其生物相容性,并最终将其应用于药物分析中。论文的主要内容包括三个部分,概括如下：第1部分：荧光碳点合成新方法研究。以血晶素为碳源,比较了煅烧和水热法制备碳点的发光性质,并最终采用水热法一步合成荧光碳点。研究发现,血晶素的碱性水溶液在聚四氟乙烯反应釜中,250℃下反应4h得到碳点,荧光量子产率达8.3%。合成的碳点不仅具有良好的光致发光特性、还有较好的水溶性和光化学稳定性。其形貌通过透射电子显微镜(TEM)表征,结果显示所合成碳点为球形或类球形,粒径分布在2-5nm,平均粒径约为3.23nm；另外,碳点在水溶液状态下的水合粒径采用动态光散射(DLS)进一步表征,约为10nm。Zeta电位分析表明碳点表面带有负电荷。高分辨透射电镜(HRTEM)成像显示其具有完整的晶体结构,晶格参数为0.22nm。X射线电子能谱与红外光谱表征结果显示碳点表面主要由C和O两种元素组成,带有羟基和羧基官能团。此外,该碳点具有良好的光致发光性能,激发与发射光谱较为对称,其荧光发射随激发波长红移而红移且强度会发生变化,最大激发与发射分别在290nm和390nm。第2部分：荧光碳点在药物分析中的应用。这一部分主要基于碳点荧光信号的改变检测药物,包括四个内容：1.基于小檗碱类猝灭CDs荧光检测小檗碱类。小檗碱类是一类广泛存在于自然界中的异奎宁生物碱,具有广泛的药理活性。研究发现小檗碱类的五种成分均可以猝灭CDs的荧光,且猝灭程度随着小檗碱类浓度的增大而增大。基于此,将CDs分别用于检测这五种小檗碱类,并在优化的条件下分别建立了线性关系。利’用此种方法检测盐酸小檗碱片中的盐酸小檗碱含量,结果与标示量一致。对猝灭机理进行研究,发现CDs的荧光发射与五种小檗碱类的吸收均有重叠,猝灭是因为CDs与它们发生能量转移。同时由于反应前后CDs荧光量子产率没有发生变化,说明CDs与小檗碱类药物之间发生了辐射能量转移而导致CDs荧光的猝灭。2.基于药根碱致CDs发射红移检测药根碱。研究发现,药根碱在碱性条件下使CDs发射峰红移,且红移程度随着药根碱浓度增大而增大。药根碱浓度在2.30μM到414μM范围内,位移值与浓度对数值呈良好的线性关系,方程式：Δλem=17.3log c-6.64(μM), r=0.995(n=10)。药根碱致CDs发射红移的机理同样是基于辐射能量转移,主要是由于药根碱的羟基在碱性条件下解离,导致吸收发生变化,与CDs的荧光发射重叠部分发生变化,不同波长处猝灭程度不同,于是发射峰红移。3.基于支链聚乙烯亚胺钝化的碳点(PEI-CDs,参考文献制备)荧光恢复检测乙酰半胱氨酸。因为铜离子能与PEI-CDs表面钝化剂上的氨基发生配位作用,从而猝灭其荧光。但如果有乙酰半胱氨酸存在,其结构上的巯基能与铜离子作用将Cu2+还原为Cu+同时自身形成二硫键,从而破坏了Cu2+与PEI-CDs表面氨基之间的作用,使得PEI-CDs荧光恢复,以此建立了PEI-CDs免标记快速、灵敏检测乙酰半胱氨酸的方法。在优化条件下,荧光恢复效率与乙酰半胱氨酸浓度在5.56μM～277.8μM范围内呈良好的线性关系,线性方程为：I/I0=0.88+0.013c(μM)，r=0.997(n=10)。4.在PEI-CDs表面偶联上FITC,基于荧光比率法检测pH。通过荧光光谱表征证明PEI-CDs上偶联了FITC。在pH6.4-7.2范围内对pH有响应,线性方程如下：I520/I450=0.550+0.0252pH, r=0.986。第3部分：CDs生物相容性的研究。首先,研究了血晶素制备的CDs及支链聚乙烯亚胺钝化的碳点(PEI-CDs,根据文献制备)和CTAB-CDs(本实验室以富勒烯为碳源,CTAB为钝化剂制备)的细胞毒性。结果发现由血晶素制备的羟基碳点浓度高达5mg/mL时也不会对细胞造成明显毒性；,但PEI-CDs浓度大于2mg/mL可见明显的细胞毒性,且细胞存活率比同浓度PEI存在时低,这是由于在PEI-CDs制备过程中有受热,可能导致PEI进一步聚合从而增大了其毒性；CTAB作为阳离子表面活性剂,其细胞毒性为众人所知,CTAB-CDs的毒性相对最强,达到0.003mg/mL细胞存活率即降低至30%。说明碳点本身细胞毒性很低,其细胞毒性最终取决于CDs表面钝化剂的毒性作用。另外以斑马鱼和豆芽为模式生物,考察了CDs和PEI-CDs对于动植物活体生物生长的影响。在0.05mg/mL CDs和PEI-CDs溶液中,均未发现有斑马鱼胚胎孵化延迟效应和胚胎发育畸形；通过数据分析发现在0.05mg/mL CDs和PEI-CDs溶液中斑马鱼仔鱼死亡率与对照组没有明显差异。CDs浓度小于0.005mg/mL时不会对豆芽的生长产生明显的阻碍,而浓度为20mg/mL时培养的豆芽根茎长则与对照组有明显差异。PEI-CDs浓度小于0.05mg/mL没有明显差异,大于0.2mg/mL则培养的豆芽根茎长与对照组有明显的差异。这些结果说明,碳点本身具有良好的生物相容性,其毒性最终取决于CDs表面钝化剂的毒性强弱。总而言之,本论文新制备了荧光碳点,并基于碳点荧光信号的改变将该碳点与另外一种PEI钝化碳点用于药物分析；最后研究了该碳点和其他两种碳点的生物相容性。

全文目录

目录  4-8
摘要  8-11
Abstract  11-15
第1部分选题依据  15-29
  第1章文献综述  15-25
    1.1 碳点制备  15-20
      1.1.1 电化学法  16
      1.1.2 激光消融法  16-17
      1.1.3 高温热解/煅烧有机物法  17-18
      1.1.4 超声法  18
      1.1.5 微波法  18
      1.1.6 水热法  18-20
    1.2 生物相容性  20
    1.3 应用  20-24
      1.3.1 生物成像  20-22
      1.3.2 生化分析检测  22-24
    1.4 存在的问题  24-25
  第2章绪论  25-29
    2.1 研究意义  25-26
    2.2 研究目标与研究内容  26
      2.2.1 研究目标  26
      2.2.2 研究内容  26
    2.3 研究技术路线  26-29
第2部分碳点合成  29-39
  第3章由血晶素水热反应一步合成荧光碳点  29-39
    3.1 前言  29-30
    3.2 实验部分  30-31
      3.2.1 实验仪器  30
      3.2.2 实验试剂  30
      3.2.3 碳点的合成与纯化  30-31
      3.2.4 TEM成像  31
      3.2.5 荧光量子产率  31
    3.3 结果与讨论  31-37
      3.3.1 碳点合成条件的优化  31
      3.3.2 碳点的表征  31-37
    3.4 结论  37-39
第3部分荧光碳点在药物分析中的应用  39-65
  第4章基于碳点荧光猝灭用于检测小檗碱类  39-47
    4.1 前言  39-40
    4.2 实验部分  40-41
      4.2.1 实验仪器  40
      4.2.2 试剂  40
      4.2.3 碳点制备  40
      4.2.4 反应液配制  40-41
      4.2.5 盐酸小檗碱片样品处理  41
    4.3 结果与讨论  41-46
      4.3.1 小檗碱类致碳点荧光猝灭光谱图  41
      4.3.2 实验条件优化  41-46
    4.4 小结  46-47
  第5章基于碳点荧光红移选择性检测盐酸药根碱  47-53
    5.1 前言  47
    5.2 实验部分  47-48
      5.2.1 仪器  47
      5.2.2 试剂  47-48
      5.2.3 实验方法与步骤  48
    5.3 结果与讨论  48-51
      5.3.1 药根碱致碳点荧光发射红移光谱  48-49
      5.3.2 实验条件优化  49-51
    5.4 结论  51-53
  第6章 PEI钝化碳点免标记荧光恢复检测半胱氨酸  53-61
    6.1 前言  53-54
    6.2 实验部分  54-55
      6.2.1 仪器  54
      6.2.2 试剂  54
      6.2.3 实验方法与步骤  54-55
    6.3 结果与讨论  55-59
      6.3.1 乙酰半胱氨酸与Cu~(2+)-PEI-CDs作用荧光光谱图  55
      6.3.2 实验条件优化  55-59
    6.4 结论  59-61
  第7章 PEI钝化碳点与FITC偶联产物的pH响应  61-64
    7.1 前言  61
    7.2 实验部分  61-62
      7.2.1 仪器  61
      7.2.2 试剂  61
      7.2.3 实验方法与步骤  61-62
    7.3 结果与讨论  62-63
      7.3.1 偶联产物荧光表征  62-63
      7.3.2 pH响应  63
    7.4 结论  63-64
  第3部分结论  64-65
第4部分碳点生物相容性研究  65-73
  第8章荧光碳点的生物相容性研究  65-73
    8.1 前言  65-66
    8.2 实验部分  66-68
      8.2.1 实验仪器  66
      8.2.2 实验试剂  66-67
      8.2.3 碳点的合成与纯化  67
      8.2.4 Cell counting kit-8(CCK-8)细胞毒性检测  67-68
      8.2.5 对斑马鱼胚胎发育的影响  68
      8.2.6 对豆芽生长的影响  68
    8.3 结果与讨论  68-71
      8.3.1 细胞毒性  68-69
      8.3.2 对斑马鱼胚胎发育的影响  69-70
      8.3.3 对豆芽生长的影响  70-71
    8.4 结论  71-73
第5部分全文总结与展望  73-75
  第9章全文总结与展望  73-75
    9.1 全文总结  73-74
    9.2 研究特色与创新之处  74
    9.3 前景展望  74-75
参考文献  75-91
科研成果  91-93
致谢  93

荧光碳点的制备及其在药物分析中的应用

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