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番木瓜中木瓜蛋白酶的提取工艺研究

作　者: 万婧
导　师: 张海德
学　校: 海南大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 木瓜蛋白酶提取乙醇超滤双水相体系酶活性
分类号: TS201.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

番木瓜(Carica Papaya),又名石瓜、万寿果、木瓜、乳瓜,原产于热带美洲及非洲,后来引种到我国。木瓜蛋白酶(Papain)是一类巯基蛋白酶,广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内,未成熟果实的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶具有较强的蛋白水解和合成能力,还具有凝乳、解脂和溶菌活力,不仅可以用来改善植物蛋白的营养价值或功能性质,而且广泛应用于食品行业。本文将通过三种提取方法的比较研究,确定各提取工艺的最佳参数以期获得具有理想酶活的木瓜蛋白粗酶,并研究亲和双水相法较传统工艺提取木瓜蛋白酶的优劣性。本课题首先探索了乙醇法提取番木瓜中木瓜蛋白酶的最适提取条件,实验结果表明,在此提取工艺中,当L-cys和EDTA添加量分别为0.04 mol／L和0.002 mol／L时,其对木瓜蛋白酶活性起到最佳保护作用,乙醇添浓度为65%,体系pH6.0时能使酶活性达到8.372万单位／mg。本课题还研究了用超滤法提取番木瓜中木瓜蛋白酶的最适提取条件,实验结果表明,在此提取工艺中,L-cys和EDTA添加量分别为0.04 mol／L和0.002 mol／L时对木瓜蛋白酶活性能起到最佳保护作用,操作压力、温度及时间分别为0.175MPa、60℃及5 min时能使酶活性达到9.398万单位／mg。此外,本课题还系统的研究了亲和双水相法提取番木瓜中木瓜粗蛋白酶的最适提取条件,结果表明,不同分子量的聚乙二醇(PEG)在双水相成相浓度范围内对木瓜蛋白酶活性影响不大；当相对PEG分子量为600,磷酸盐浓度为16%,体系pH6.0时能使酶活性达到10.376万单位／mg的最佳活性。同时,通过实验也考察了外加盐NaCl、KBr和CaCl2对双水相形成区域的影响,在选定的实验条件下,进一步优化了双水相体系以期获得较高酶活性回收率,结果表明,当PEG平均分子量为600,浓度20%,磷酸盐浓度16%,pH 6.0时,在室温条件下,木瓜蛋白酶分配系数达到3.26,酶活性回收率可高达92.4%。通过研究比较了三种提取工艺的同时也验证试验了反应时间与温度在酶活性测定过程中对木瓜蛋白酶活性的影响,结果表明：木瓜蛋白酶在在30～90℃之间均有一定活力,且在80℃时木瓜蛋白酶活性达到最高,说明该酶对温度不敏感且具有耐高温的特性。40℃条件下,20 min为最适反应时间。本课题首次将传统工艺与双水相萃取法提取木瓜粗蛋白酶工艺的条件进行了研究比较。统计结果表明：三种方法中,双水相法所提取的酶活性最高,有机溶剂—乙醇提取法所提取的酶活性最差。同时,在提取过程中发现,有机溶剂提取蛋白酶过程中其溶剂加料点不易掌握,过点易破坏蛋白质的氢键从而易引起变性失活。超滤法提取较有机溶剂提取温和不易发生相变、失活等现象,但易在膜表面产生浓差极化现象,从而影响提取效率和提取效果。双水相法提取番木瓜中粗蛋白酶,其操作过程相对较易掌握,分相快且操作条件温和易于放大和进行连续性操作,同时双水相体系对蛋白质分子也有一定的稳定作用,但双水相体系两相中影响分配行为的因素也比较复杂,其规律还有待进一步研究。综上所述,双水相法较两种传统的提取方法相比,能显示出很强的优越性。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 前言  11-19
  1.1 木瓜蛋白酶的研究概况  11
  1.2 木瓜蛋白酶的结构组成及性质  11-12
  1.3 木瓜蛋白酶的应用研究概况  12-14
    1.3.1 肉类加工  12
    1.3.2 啤酒澄清  12
    1.3.3 饲料添加  12-13
    1.3.4 医学药用  13
    1.3.5 化工产品  13-14
  1.4 木瓜蛋白酶的提取方法研究  14-18
    1.4.1 传统工艺提取木瓜蛋白酶  14-15
    1.4.2 双水相萃取法提取木瓜蛋白酶  15-18
  1.5 本项目的主要研究内容及意义  18-19
2 乙醇提取木瓜蛋白酶的工艺研究  19-25
  2.1 材料与方法  19-20
    2.1.1 实验材料  19
    2.1.2 实验试剂及生产单位  19
    2.1.3 实验仪器  19
    2.1.4 乙醇提取木瓜蛋白酶的工艺流程  19-20
    2.1.5 操作步聚  20
    2.1.6 数据处理  20
  2.2 结果与分析  20-24
    2.2.1 酶活保护剂添加量对木瓜蛋白酶活性的影响  20-21
    2.2.2 pH对木瓜蛋白酶活性的影响  21-22
    2.2.3 乙醇浓度对木瓜蛋白酶活性的影响  22-23
    2.2.4 正交实验考察乙醇提取木瓜蛋白酶的最佳工艺条件  23-24
  2.3 小结  24-25
3 超滤法提取木瓜蛋白酶的工艺研究  25-33
  3.1 材料与方法  25-26
    3.1.1 实验材料  25
    3.1.2 主要实验试剂及生产单位  25
    3.1.3 实验仪器  25
    3.1.4 超滤法提取木瓜蛋白酶的工艺流程  25-26
    3.1.5 实验步聚  26
    3.1.6 数据处理  26
  3.2 结果与分析  26-32
    3.2.1 预处理过程中酶活保护剂添加量对木瓜蛋白酶活性的影响  26-27
    3.2.2 预处理过程中pH对木瓜蛋白酶活性的影响  27-28
    3.2.3 正交实验考察超滤法中木瓜蛋白酶预处理的最佳工艺条件  28
    3.2.4 正交试验结果与分析  28-29
    3.2.5 操作压力对膜通量及木瓜蛋白酶活性的影响  29-30
    3.2.6 操作温度对膜通量及木瓜蛋白酶活性的影响  30
    3.2.7 操作时间对膜通量及木瓜蛋白酶活性的影响  30-31
    3.2.8 正交实验考察超滤法中各因素对木瓜蛋白酶活性的影响  31
    3.2.9 正交试验结果与分析  31-32
  3.3 小结  32-33
4 双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的工艺研究  33-42
  4.1 材料与方法  33-34
    4.1.1 实验材料  33
    4.1.2 实验试剂  33
    4.1.3 实验仪器  33
    4.1.4 双水相法提取木瓜蛋白酶的工艺流程  33-34
    4.1.5 操作步聚  34
    4.1.6 数据处理  34
  4.2 结果与分析  34-41
    4.2.1 不同成相因素对木瓜蛋白酶的影响考察  34-36
    4.2.2 木瓜蛋白粗酶在PEG/磷酸盐双水相体系中的分配行为研究  36-41
  4.3 小结  41-42
5 T检验法分析  42-43
6 木瓜蛋白酶活性测定  43-47
  6.1 材料与方法  43-44
    6.1.1 实验材料  43
    6.1.2 主要实验试剂及生产单位  43
    6.1.3 主要实验仪器  43
    6.1.4 紫外分光光度法测定木瓜蛋白酶活性  43-44
  6.2 结果与分析  44-46
    6.2.1 温度对木瓜蛋白酶活性的影响  44-45
    6.2.2 时间对木瓜蛋白酶酶活性的影响  45-46
    6.2.3 金属离子对木瓜蛋白酶酶活性的影响  46
  6.3 小结  46-47
7 结论与展望  47-49
  7.1 结论  47
  7.2 展望  47-49
参考文献  49-53
致谢  53-54
研究生期间发表的论文  54

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