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自然种群间不相容性作为蚊媒数量控制的基础及其机制研究

作　者: 张东辉
导　师: 朱昌亮
学　校: 南京医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 蚊媒自然种群交配实验淡色库蚊生物防制沃尔巴克氏体媒介昆虫种群数量昆虫组织孵化率 Culex mosquitoes 胞质不相容控制媒介 incompatible 不相容性 Wolbachia 幼虫杂交子一代数量控制
分类号: Q968.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

蚊媒病一直是危害人类健康的重要公共卫生问题之一。随着全球化、城市化的发展以及全球气候变暖,蚊媒病的威胁在不断增长。进一步加强蚊媒防制研究是应对公共卫生突发事件的重要举措。化学防制一直是蚊媒防制规划中的主要方法,然而连续和大量地使用杀虫剂导致蚊媒抗药性的发生和发展,蚊媒抗药性以及随着工业化产生的环境改变加剧了蚊媒病传播的恶化趋势。同时使用杀虫剂对人类健康和环境的负面影响也不容忽视。在这种情况下,生物防制作为化学防制的可能的补充或替代而备受关注。生物防制方法的核心策略之一是通过生物学措施(包括遗传学手段)达到媒介昆虫种群数量控制的目的。很多雌性昆虫具有一生仅交配1次的属性,如蚊。如果一生唯一的交配是不育的交配,将可以降低媒介昆虫种群繁殖能力甚至阻断其繁殖,而达到控制媒介昆虫种群数量的目的。利用这一原理的防制方法包括昆虫不育技术(sterile insect technique, SIT)和昆虫不相容技术(incompatible insect technique, IIT)。昆虫不育技术利用辐射或化合物诱导后产生的不育雄性昆虫,昆虫不相容技术利用生殖不相容的雄性昆虫,两者皆通过大量释放以上雄性昆虫与自然界雌性昆虫交配,达到控制媒介昆虫自然种群数量的目的。现今,昆虫不相容技术使用最多的是沃尔巴克氏体(Volbachia)导致的宿主生殖细胞胞质不相容现象(cytoplasmic incompatibility, CI,亦译作胞质不亲和性)。沃尔巴克氏体感染后宿主生殖细胞胞质不相容现象的存在可使交配后的雌性媒介昆虫不能产生子代,或者大大降低了其生育繁殖能力,进而控制媒介昆虫种群数量。使用人工感染或反复回交的方法将沃尔巴克氏体导入昆虫用以数量控制已在若干媒介昆虫(包括蚊)中进行了尝试,并取得令人鼓舞的效果。然而,制备不相容媒介昆虫的过程常常需要大量的实验室工作,耗费大量的时间,且对实验人员的专业技术水平要求较高,如去除媒介昆虫种群中原感染的沃尔巴克氏体,再人工感染另一种类型的沃尔巴克氏体,或者两个媒介昆虫种群反复回交(如沃尔巴克氏体感染种群与未感染种群数代回交)等等。由此产生的不相容昆虫的应用也取决于新的昆虫-沃尔巴克氏体共生关系的长期稳定性。而自然种群经过长期选择、进化,比人工创造新的蚊种群稳定。因此,自然种群是否可直接作为不相容昆虫用于媒介昆虫的数量控制值得进一步研究。本研究选择中国东部江苏南京、无锡和山东唐口3个地区淡色库蚊自然种群为研究对象,研究了种群中的沃尔巴克氏体感染和种群间的生殖不相容现象,进一步探讨以自然种群间不相容性为基础的昆虫不相容技术的可行性,以期为媒介昆虫控制提供一种有效的补充或替代方法。本研究的主要研究结果如下：1、淡色库蚊自然种群间存在不相容现象使用南京(NJ)、无锡(WX)、唐口(TK)3个淡色库蚊自然种群进行正反向交配实验,并检测了各组雌蚊的孵化率。各组蚊笼中放入相同数量的处女雌蚊和雄蚊交配48小时后喂血,产卵后卵筏单独孵化,并计数每个卵筏的卵数和幼虫孵化数,分析得出孵化率。唐口、无锡种群交配实验中,TK♀×WX(?)组TK雌蚊产卵的孵化率显著低于对照组TK♀xTK(?)(P<0.0001),且WX♀xTK(?)组WX雌蚊产卵的孵化率显著低于对照组WX♀×WX(?)(P<0.0001)：同样唐口、南京种群交配实验中,TK♀xNJ(?)组TK雌蚊产卵的孵化率显著低于对照组TK♀×TK(?)(P<0.0001),且NJ♀xTK(?)组NJ雌蚊产卵的孵化率显著低于对照组NJ♀xNJ(?)(P<0.0001)；而在南京、无锡种群交配实验中发现杂交组的孵化率和对照组无明显差异。提示淡色库蚊唐口种群与无锡种群,唐口种群与南京种群间存在不相容现象。2、淡色库蚊自然种群间的不相容现象非交配失败导致各实验组雌蚊所产卵孵化48小时后,我们在显微镜下观察到了明显的胚胎发育现象。在相容的交配组雌蚊所产卵中,我们可以看到沿中轴线产生的分节,在卵的前端,2个红点代表原始的眼睛也清晰可见。而不相容交配实验组卵的胚胎发育中,毛杂乱无章,可以见到1-3(多为2)个原始的眼睛(侧单眼)的形成,它们大多位于头部区域,但却似乎并没有一个特定的定位。在有些卵中,2个侧单眼前后排列而不是左右排列,此外某些卵中能看到沿着轴线的分节现象,以上现象表明,不相容组的雌蚊确实与雄蚊进行了交配。3、雌蚊与异源不相容雄蚊交配后不再与同源相容雄蚊二次交配一次交配实验后雌蚊被分离出来,平均分为两组,一组与等数量的同源相容雄蚊混合,一组保持独居作为对照,如果二次交配发生,则此实验中与同源相容雄蚊混合的雌蚊储精囊中会增加相容雄蚊的精子,受精并产生与分离后独居组雌蚊相比更多的子代；相反,若无二次交配发生,则子代数量无差别。结果显示,二次交配实验中两组雌蚊产卵的孵化率无显著差异,提示实验中的雌蚊在与异源不相容雄蚊交配后便不再与同源相容雄蚊二次交配。4、不相容雄蚊以数量依赖方式竞争性降低雌蚊繁殖力雌蚊分别与相容雄蚊、比例逐渐增多的不相容雄蚊进行竞争交配实验,混合48小时充分交配,吸血产卵后卵筏单独孵化,计数每个卵筏的卵数和幼虫孵化数,分析得出孵化率。TK♀×TK(?)组卵平均孵化率为0.861±0.020,[TK♀×(TK(?)+WX(?))]组卵平均孵化率降为0.211±0.071,而[TK♀×(TK(?)+3xWX(?))]组卵平均孵化率只有0.063±0.039,TK♀×WX(?)组为0.004±0.003,随着不相容雄蚊的增多,雌蚊产卵的平均孵化率逐渐降低。同样地,WX♀×WX(?)组平均孵化率为0.903±0.013,[WX♀×(WX(?)+TK(?))]组降为0.607±0.066,[WX♀×(WX(?)+3xTK(?))]仅为0.001±0.001,而WX♀xT(?)为0.001±0.001,雌蚊产卵的平均孵化率亦随着不相容雄蚊的增加而降低。以上结果提示,不相容雄蚊以数量依赖方式竞争性降低雌蚊繁殖力。我们将TK♀、WX♀繁殖力的降低与混入不相容的雄蚊数量之间的相关性进行分析。结果显示,从理论上说,引入足够数量的WX(?)时,TK♀繁殖力将可以在很大程度上被削弱,如,当混入9x数量的WX♂时,可以将TK♀的繁殖力降低为0；而混入足够数量的TK(?)时,最多可以在一代中将WX♀的繁殖力降低90%左右。TK♀、WX♀繁殖力的降低与混入不相容的雄蚊数量之间的相关性系数r2分别为0.92((?P<0.05)和0.9363(P<0.05)。5、不相容交配子代具有与母本相似的不相容属性(交配型)当释放不相容WX(?)控制目标TK种群的数量时,TK♀与WX(?)交配产生杂交子一代F1♀(TK♀×WX♂)、F1♂(TK♀×WX(?)),子一代会遇到TK♀,TK(?)和WX(?),如此,会有6种交配的组合产生的可能,即：F1(TK♀×WX(?))♀×F1(TK♀×WX(?))(?)、F1(TK♀×WX♂)♀×TK(?)、F1(TK♀×WX♂)♀×WX(?)、TK♀×F1(TK♀×WX(?))♂、TK♀×WX(?)、TK♀×TK(?)。我们额外增加了3组配对实验,即：WX♀×Fl♂(TK♀×WX(?)),WX♀×WX(?),WX♀×TK(?),这3组交配实验组合可以提供更多关于F1(?)(TK♀×WX(?))相容性属性的信息。我们分析比较了这9种交配组合的平均孵化率。结果显示,F1♀(TK♀×WX(?))×F1(?)(TK♀×WX(?))和F1♀(TK♀×WX(?))×TK(?)组平均孵化率无显著差异。F1♀(TK♀×WX♂)×WX(?)组没有子代幼虫产生。提示F1♀(TK♀×WX(?))保持了与母本TK♀相似的不相容属性。另一方面,TK♀×F1(?)(TK♀×WX(?))和TK♀×TK♂组平均孵化率很高,且无显著差异,而WX♀×F1♂(TK♀×WX(?))和WX♀×TK(?)组平均孵化率很低,亦无显著差异,提示F1(?)(TK♀×WX(?))保持了与父本TK(?)相似的不相容属性。同样地,在不断释放TK(?)进入WX自然种群时,我们也进行了九种组合的交配实验,结果同样提示F1♀(WX♀xTK♂)保持了与母本WX♀相似的不相容属性、F1(?)(WX♀×T(?))保持了与父本TK(?)相似的不相容属性。以上结果表明,采用种群间自然存在的不相容性控制蚊媒数量为一种可持续操作的策略。6、淡色库蚊自然种群间存在不同的沃尔巴克氏体感染南京(NJ)、无锡(WX)、唐口(TK)3个自然种群均感染了沃尔巴克氏体,南京种群感染的沃尔巴克氏体属于wPip-Ⅲ组,无锡、唐口种群感染的沃尔巴克氏体属于wPip-Ⅳ组。7、四环素去除沃尔巴克氏体后种群间的不相容性也被去除WX♀分别与相同数量四环素处理后的TK(?)(即TKtet(?))、TK(?)、WX(?)进行了交配实验,TK♀分别与相同数量四环素处理后的WX(?)(即WXtet♂)、WX(?)、TK(?)进行了交配实验。计数分析了各组平均孵化率,结果显示,WX♀×TKtet(?)组与WX♀×WX(?)组的平均孵化率无统计学差异,但都高于WX♀×TK(?)组；TK♀×WXtetd组与TK♀×TK(?)组的平均孵化率无统计学差异,但都高于TK♀×WX(?)组。以上结果提示,种群间自然存在的不相容性是沃尔巴克氏体感染导致的胞质不相容性。

全文目录

中文摘要  7-12
Abstract  12-19
前言  19-23
第1部分淡色库蚊自然种群间不相容现象作为蚊数量控制基础  23-46
  材料与方法  24-28
    一、实验材料  24-25
      (一) 实验蚊  24-25
      (二) 交配实验用蚊  25
      (三) 主要仪器  25
    二、实验方法  25-28
      (一) 淡色库蚊3个种群间交配实验  25-26
      (二) 交配是否成功的判定  26
      (三) 交配实验后二次交配实验  26
      (四) 竞争交配实验  26-27
      (五) 子一代交配实验  27-28
  结果  28-46
    一、淡色库蚊自然种群交配实验  28-46
      (一) 南京种群、无锡种群、唐口种群间不相容现象  28-30
      (二) 淡色库蚊3个种群间的不相容现象非交配失败导致  30-32
      (三) 雌蚊与异源不相容雄蚊交配后不再与同源相容雄蚊二次交配  32-35
      (四) 不相容雄蚊以数量依赖方式竞争性降低雌蚊繁殖力  35-41
      (五) 淡色库蚊3个种群间的不相容性在杂交子代中延续  41-46
第2部分淡色库蚊自然种群间不相容现象机制研究  46-68
  材料与方法  47-56
    一、实验材料  47-48
      (一) 实验蚊  47
      (二) 质粒和菌株  47
      (三) 主要试剂  47
      (四) 培养基及主要溶液  47-48
      (五) 主要仪器  48
    二、实验方法  48-56
      (一) 单蚊基因组DNA提取  48-49
      (二) 单蚊Wobachia wsp基因检测  49-54
      (三) 单蚊Wobachia ank2基因检测  54-55
      (四) 四环素处理去除沃尔巴克氏体  55
      (五) 荧光染色  55
      (六) 去除沃尔巴克氏体后的交配实验  55-56
  结果  56-68
    一、单蚊基因组DNA提取、鉴定  56
    二、单蚊Wobachia wsp基因检测  56-60
      (一) 基因组DNA为模板wsp基因扩增  56-57
      (二) 重组子鉴定  57-58
      (三) 淡色库蚊wsp基因片段测序结果  58-60
    三、单蚊Wobachia-ank2基因检测  60-64
      (一) 单蚊基因组DNA为模板ank2基因扩增  60-61
      (二) 重组子鉴定  61
      (三) 淡色库蚊ank2基因片段测序结果  61-64
    四、环素处理淡色库蚊3个种群去除沃尔巴克氏体  64
    五、环素处理后淡色库蚊3个种群交配实验  64-68
讨论  68-74
小结  74-76
参考文献  76-83
综述  83-93
  References  89-93
附录  93-97
  在读期间发表的论文  93-95
  在读期间获得授权的专利  95
  在读期间获奖  95-96
  在读期间报告的基因新序列  96-97
附件  97-108
致谢  108

自然种群间不相容性作为蚊媒数量控制的基础及其机制研究

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