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ThLEA3基因过表达提高黄檗抗渗透胁迫能力的机理研究

作　者: 杨静莉
导　师: 李成浩
学　校: 东北林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 黄檗农杆菌介导转基因晚期胚性富集蛋白基因信号转导脱落酸
分类号: Q945.78
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

晚期胚胎富集蛋白(Late embryogenesis abundant protein, LEA)是一类在植物种子成熟期间高富集的与渗透调节有关的多功能的逆境蛋白。研究结果表明LEA基因可以在干旱和ABA处理条件下诱导表达,并且LEA蛋白的表达与ABA变化相一致；很多LEA基因的过表达能提高植物的抗旱能力,但其参与植物抗逆胁迫的分子机制还未深入研究,对其结构和功能的了解尚不完善,且存在很多争议。本研究主要以转柽柳LEA3基因的转基因黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)为研究对象,通过对转基因黄檗在渗透胁迫下的生理指标变化、气孔关闭程度、荧光分子探针标记、非损伤微测技术和转录组测序等研究NO、H2O2和ABA在诱导气孔关闭过程中的变化规律,初步研究柽柳LEA3基因在渗透胁迫下快速诱导气孔关闭的调控机理,探索在渗透胁迫条件下的分子保护机制。其主要的实验结果如下：(1)经7%PEG6000处理10小时后,对照的黄檗叶片有明显的萎蔫现象,叶片严重失水；而转ThMT3转基因黄檗的叶片保持正常,说明ThLEA3基因的过表达提高了转基因黄檗的抗渗透胁迫能力。各种生理指标的比较结果表明,在渗透胁迫下,与对照相比,转基因黄檗的SOD、CAT的活性没有明显的差异,而脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量均高于非转基因对照。(2)扫描电镜观察结果表明,7%PEG6000处理5小时后,转基因株系的气孔关闭,而非转基因对照的气孔是开着的,同时保卫细胞发生变形,说明ThLEA3转基因黄檗组培苗通过气孔的快速关闭来抵抗渗透胁迫。(3)荧光分子探针检测结果表明,转基因黄檗气孔中的NO荧光强度高于对照,而转基因黄檗气孔中的H202荧光强度低于对照。ABA、H2O2、SNP及PEG6000处理能引起转基因株系的气孔中Ca2+的荧光强度,并引起气孔关闭；而不能引起对照的气孔关闭。非损伤微测技术检测结果表明PEG6000处理引起转基因植株气孔中Ca2+内流,H+、K+外流,最终导致气孔的关闭,而对照气孔中Ca2+、H+、K+全部外流,导致气孔不能关闭和保卫细胞的破坏。(4)内源ABA含量检测结果表明,在渗透处理之前非转基因对照(NT)叶片中ABA含量高于ThLEA3转基因植株。而7%PEG6000处理之后,两者ABA的含量提高幅度都很大,但是胁迫后的还是对照叶片中ABA含量高于转基因叶片。(5)为进一步在基因水平上验证相关基因的表达,我们利用Illumina高通量测序技术测定了转基因及对照组培苗叶片的转录组。测序分析结果表明,ThLEA3转基因引起大量基因表达量的变化,即有30,494个差异表达的基因,其中有12263个基因是上调表达的,有18231个基因是下调表达的。进一步分析表明,与对照相比,ABA合成代谢途径的各类基因在转基因黄檗中呈现出从上游基因上调到下游基因下调逐渐过渡的趋势,而且ABA的生物合成途径的最后一个关键基因abscisic aldehyde oxidase (AAO)的同源基因全部下调表达。另外,调控NO合成的NOS和NR基因都上调表达。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-11
1 绪论  11-19
  1.1 引言  11-12
  1.2 干旱胁迫下ABA依赖型信号转导途径  12-14
    1.2.1 依赖于Ca~(2+)信号的途径  12-13
    1.2.2 不依赖Ca~(2+)信号的途径  13-14
  1.3 LEA基因的研究概况  14-16
    1.3.1 LEA基因的分类、结构特点及功能  14-16
    1.3.2 LEA基因的作用机制  16
  1.4 黄檗遗传转化的研究进展  16-17
  1.5 本研究的目的与意义  17
  1.6 研究的主要内容  17-19
    1.6.1 转柽柳ThLEA3基因黄檗的抗渗透胁迫机理研究  17-18
    1.6.2 转ThLEA3黄檗的转录组分析  18-19
2 转ThLEA3黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)的抗渗透胁迫机理研究  19-46
  2.1 材料与方法  19-29
    2.1.1 植物材料  19
    2.1.2 主要试剂  19
    2.1.3 主要仪器  19-20
    2.1.4 转基因黄檗的渗透胁迫处理  20
    2.1.5 渗透胁迫下生理指标的测定  20-23
    2.1.6 渗透胁迫下气孔开度的观察  23
    2.1.7 渗透胁迫下叶片中NO含量的测定  23-25
    2.1.8 气孔保卫细胞中NO和H202的荧光强度观察  25
    2.1.9 渗透胁迫下保卫细胞中H202的荧光观察及含量的测定  25-26
    2.1.10 非损伤微测技术测定渗透胁迫下保卫细胞中H_2O_2的流速  26-27
    2.1.11 保卫细胞中Ca~(2+)的荧光观察及气孔开度变化  27-28
    2.1.12 非损伤微测技术测定保卫细胞中Ca~(2+)、K~+、H~+流速  28-29
    2.1.13 高效液相色谱法测定ABA含量  29
  2.2 结果与讨论  29-44
    2.2.1 ThLEA3转基因黄檗具有抗渗透胁迫能力  29-30
    2.2.2 渗透胁迫下生理指标的变化  30-32
    2.2.3 渗透胁迫下ThLEA3转基因黄檗气孔关闭  32-33
    2.2.4 NO可能参与渗透胁迫下转ThLEA3黄檗气孔的关闭  33-34
    2.2.5 H_2O_2间接地参与渗透胁迫下转基因植株气孔的信号转导过程  34-37
    2.2.6 短时间的PEG6000、ABA、H_2O_2及SNP诱导气孔的关闭  37-41
    2.2.7 ThLEA3转基因黄檗的气孔关闭途径中胞内Ca~(2+)与K~+的关系  41-42
    2.2.8 胞质pH对转基因黄檗气孔关闭的影响  42-43
    2.2.9 该途径为ABA诱导的信号转导途径  43-44
  2.3 小结  44-46
3 转ThLEA3黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)的转录组分析  46-66
  3.1 材料与方法  46-50
    3.1.1 植物材料  46
    3.1.2 黄檗总RNA的提取及Illumina测序步骤  46
    3.1.3 数据的分析  46-49
    3.1.4 实时荧光定量PCR验证相关基因的表达  49-50
  3.2 结果与讨论  50-64
    3.2.1 测序量统计及组装结果  50
    3.2.2 Unigene的功能注释  50-53
    3.2.3 差异基因的表达分析结果  53-55
    3.2.4 参与ABA信号转导途径相关基因在黄檗中的表达  55-56
    3.2.5 DNA复制的基因表达下调  56-57
    3.2.6 ABA、赤霉素(GA_3)及油菜素内酯基因的KEGG pathway途径分析  57-63
    3.2.7 RT-PCR验证相关基因的表达  63-64
  3.3 小结  64-66
结论  66-68
参考文献  68-77
附录  77-79
攻读学位期间发表的学术论文  79-80
致谢  80-81

ThLEA3基因过表达提高黄檗抗渗透胁迫能力的机理研究

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