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Asial型FMDV复合表位免疫原的研制及免疫效果研究

作　者: 曹永生
导　师: 王君伟
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: Asia1型口蹄疫复合表位免疫途径免疫效果黏膜免疫
分类号: S852.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

口蹄疫(Foot-and-mouth Disease, FMD)作为一种全球范围内的重大动物疫病,已成为当前动物及其产品国际贸易的主要障碍。O、A、Asial型FMD是我国一直以来的防治重点,灭活疫苗在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用。机体抵抗口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus, FMDV)感染过程中,依赖于中和抗体的体液免疫反应是最主要的。虽然灭活疫苗免疫能够产生高水平的中和抗体,但高水平的中和抗体并不是总能为机体提供完全的保护,同时CD4+T细胞在诱导机体体液抗体水平方面发挥着重要的作用,提示同时提高机体的体液免疫和细胞免疫对于FMD的预防更有意义。复合表位疫苗减少了疫苗中与免疫无关的成分,同时可对T、B细胞抗原表位进行不同组合,是实现口蹄疫体液免疫应答和细胞免疫应答的理想选择。FMDV主要是依靠接触和空气进行传播,黏膜免疫应答能够在黏膜部位产生大量的分泌性的sIgA,分泌性的sIgA不仅可以在第一时间中和病毒,而且可通过黏膜的方式进一步激活系统免疫反应,进而阻止病毒的侵入。所以有效的诱导黏膜部位产生sIgA是口蹄疫疫苗发展的新方向。本研究人工设计了复合表位肽,并分别以乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和牛IgG2a Fc片段为载体,利用原核表达系统和毕赤酵母表达系统,制备三种复合表位免疫原pET28a-HBc-EB、 pET22b-EB-BIg和rGS115-pPICZA-HBc-EB,通过腹腔注射、口服和滴鼻三种途径分别对小鼠进行免疫,从体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫水平对复合表位疫苗的免疫效果进行综合评价。(1) Asial型FMDV复合表位免疫原的设计及合成选取VP1上第140-160位、第200～211位两个B细胞表位和VP1上第20～40位、3A上第21～35两个T细胞表位为候选表位,并在其间引入合适的linker序列,构成了Asial型FMDV的复合表位。该复合表位肽通过linker序列GSGSG融合于HBcAg的第78～79位氨基酸(刺突位置),软件分析表明,Linker序列在表位之间形成柔性区域和转角,特别是序列(G4S)3的引入保证了两个B细胞表位的独立作用,而复合表位肽所在的HBc刺突位置具有较高的抗原性且大部分存在于表位部分,并有出现在分子表面的可能性,将融合有复合表位的HBc Ag序列优化后合成。(2)复合表位免疫原在原核表达系统中的制备及腹腔免疫效果评价1)复合表位免疫原在原核表达系统中的制备以合成的质粒pUC57-simple-HBc-EB为模板,PCR扩增出目的基因,产物酶切后与pET28a连接,得到重组表达质粒pET28a-HBc-EB。以合成的含有牛IgG2a Fc片段基因的pUC57-simple-BIg质粒为模板,扩增出牛IgG2a Fc片段基因,并利用融合PCR方法与复合表位基因连接,酶切后与pET22b连接,得到重组表达质粒pET22b-EB-BIg。复性后的重组pET28a-HBc-EB在电镜下可观察到病毒样粒子的存在,而重组蛋白pET22b-EB-BIg也形成了类似免疫球蛋白单体的形式,能够与兔抗牛抗体直接结合。Western blot鉴定结果表明两免疫原均具备良好的抗原性,更为重要的是Dot ELISA结果显示复性后的复合表位免疫原能够与Asial型FMDV VP1构象表位抗体很好的结合,间接说明复合后的表位免疫原能够一定程度上折叠为类似于Asial型VP1蛋白构象型表位的抗原结构。2)复合表位免疫原腹腔免疫效果评价免疫后28d的检测结果表明,pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组小鼠抗体水平显著高于疫苗免疫组(P<0.01或P<0.05),pET28a-HBc-EB组的抗体水平显著高于pET22b-EB-BIg组(P<0.05); pET28a-HBc-EB组液相阻断抗体效价高于疫苗免疫组,为1:256-1:512;而pET22b-EB-BIg组液相阻断抗体效价为1：128～1：256,与灭活疫苗组相当；pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组的淋巴细胞刺激指数显著高于灭活疫苗免疫组(P<0.01)。pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组的CD4+/CD8+比值显著高于灭活疫苗组(P<0.01,P<0.05)。pET28a-HBc-EB组和pET22b-EB-BIg组小鼠脾细胞刺激后产生的IL-2和IFN-γ显著高于灭活疫苗组(P<0.01),pET28a-HBc-EB组IL-4和IL-10产生水平显著高于灭活疫苗组(P<0.05),而pET22b-EB-BIg组与灭活疫苗组无显著差异。表明Asial型FMDV多表位免疫原具有良好的免疫效果,既可刺激机体产生高水平的体液免疫,又可以刺激机体发生细胞免疫,其中以pET28a-HBc-EB组免疫效果最佳。复合表位免疫原腹腔免疫较为理想的效果证实了复合表位免疫原的有效性,为口服免疫和滴鼻免疫提供了保证。(3)复合表位免疫原在毕赤酵母表达系统中的制备及口服免疫效果评价1)复合表位免疫原在毕赤酵母表达系统中的制备本研究鉴于毕赤酵母具备真核细胞表达系统的修饰功能的特点,以期获得具有天然结构的复合表位免疫原。酶切重组质粒pET28a-HBc-EB,获得复合表位多肽基因,与pPICZA胞内表达载体连接,获得重组质粒pPICZA-HBc-EB;以本实验保存的含有Asial型FMDV全基因的质粒为模板,分别扩增病毒衣壳蛋白编码基因,并分别克隆于毕赤酵母表达载体pPICZA中,然后通过PCR方法在含有各表达盒两端引入酶切位点,各表达盒经酶切后依次将连入pPICZA载体中,最终构建酵母表达质粒pPICZA-vp031; Western blot和Dot ELISA鉴定结果表明表达产物具有良好的抗原性。2)重组毕赤酵母以5×108CFU剂量口服免疫小鼠,免疫后28d检测结果表明,pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vpO31组抗体水平显著低于灭活疫苗免疫组(P<0.01)；液相阻断抗体效价为1：8～1：16；毕赤酵母免疫组小鼠黏膜冲洗液sIgA和特异性sIgA总量显著高于疫苗组(P<0.01); pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组的黏膜特异性sIgA显著高于灭活疫苗组(P<0.01); pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组淋巴细胞增殖指数均显著高于灭活疫苗免疫组(P<0.01),而pPICZA-HBc-EB组显著高于pPICZA-vpO31组(P<0.05)；灭活疫苗组CD4+/CD8+比值显著高于pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组(P<0.01)：pPICZA-HBc-EB组小鼠脾细胞刺激后产生的IL-2和IFN-γ显著高于灭活疫苗组(P<0.01),而pPICZA-vp031组则与灭活疫苗组无显著差异(P>0.05),pPICZA-HBc-EB组和pPICZA-vp031组IL-4和IL-10水平与灭活疫苗组无显著差异(P>0.05)。说明口服重组酵母菌不仅可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,而且还能显著地诱导机体黏膜免疫。证实了复合表位免疫原通过口服免疫激发黏膜免疫的可行性。(4)复合表位免疫原滴鼻免疫效果的评价利用原核系统制备的复合表位疫苗对小鼠进行滴鼻免疫,免疫后28d pET22b-EB-BIg组抗体水平显著高于pET28a-HBc-EB组(P<0.01),显著低于灭活疫苗免疫组(P<0.01),且抗体上升趋势较为缓慢；液相阻断抗体效价低于1:8; pET22b-EB-BIg滴鼻免疫组黏膜冲洗液总sIgA水平、黏膜特异性sIgA抗体水平显著高于灭活疫苗组、pET28a-HBc-EB滴鼻免疫组(P<0.01)；pET22b-EB-BIg滴鼻免疫组的刺激指数显著高于其他各组(P<0.05)；pET22b-EB-BIg滴鼻免疫组CD4+/CD8+比值显著低于灭活疫苗免疫组(P<0.01)。上述结果说明pET22b-EB-BIg免疫后小鼠上支气管和肺部冲洗液、肠冲洗液和生殖道冲洗液中均有特异性sIgA的分泌,同时机体产生一定的体液免疫和细胞免疫,而pET28a-HBc-EB则无此效应,首次实践了靶向FcRn激发黏膜免疫的可行性,为FMD黏膜疫苗的制备提供一种新的思路。

全文目录

目录  4-6
CONTENTS  6-8
摘要  8-11
Abstract  11-15
1 前言  15-29
  1.1 口蹄疫概述  15-18
    1.1.1 病原特性  15
    1.1.2 口蹄疫病毒主要抗原位点  15-17
    1.1.3 传播途径  17
    1.1.4 流行现状  17-18
  1.2 黏膜免疫研究进展  18-22
    1.2.1 黏膜免疫系统  18-19
    1.2.2 黏膜免疫佐剂  19
    1.2.3 靶向性黏膜免疫投递载体  19-22
  1.3 口蹄疫新型基因工程疫苗研究现状  22-28
    1.3.1 亚单位疫苗  22-23
    1.3.2 合成肽疫苗  23
    1.3.3 新型减毒疫苗和分子标记疫苗  23-24
    1.3.4 核酸疫苗  24
    1.3.5 转基因植物可饲疫苗  24
    1.3.6 活载体疫苗  24-25
    1.3.7 表位疫苗  25-27
    1.3.8 黏膜疫苗  27-28
  1.4 研究的目的与意义  28-29
2 材料与方法  29-49
  2.1 材料  29-33
    2.1.1 试验动物  29
    2.1.2 菌株和质粒  29
    2.1.3 灭活疫苗、包被抗原和抗体  29
    2.1.4 引物设计及合成  29-30
    2.1.5 主要试剂和试剂盒  30-31
    2.1.6 主要仪器  31-32
    2.1.7 主要溶液的配制  32-33
  2.2 试验一 Asial型FMDV复合表位免疫原的制备  33-44
    2.2.1 以HBcAg为载体复合表位免疫原的原核表达  33-38
    2.2.2 以牛IgG2a Fc片段为载体的复合表位免疫原的制备  38-39
    2.2.3 Asial型FMDV衣壳蛋白在酵母中的共表达  39-44
    2.2.4 以HBcAg为载体复合表位免疫原在酵母中的表达  44
  2.3 试验二复合表位免疫原免疫途径与免疫效果的研究  44-49
    2.3.1 腹腔免疫及免疫效果评价  44-46
    2.3.2 口服免疫及免疫效果评价  46-48
    2.3.3 滴鼻免疫及免疫效果评价  48-49
3 结果与分析  49-76
  3.1 试验一 Asial型FMDV复合表位免疫原的制备  49-64
    3.1.1 复合表位免疫原的设计  49-51
    3.1.2 复合表位免疫原的原核表达  51-57
    3.1.3 阳性重组酵母菌的获得  57-64
  3.2 试验二复合表位免疫原免疫途径与免疫效果的评价  64-76
    3.2.1 腹腔免疫及免疫效果评价  64-67
    3.2.2 口服免疫及免疫效果评价  67-71
    3.2.3 滴鼻免疫及免疫效果评价  71-76
4 讨论  76-82
  4.1 Asia1型FMDV复合表位免疫原的设计  76-77
  4.2 复合表位免疫原的制备  77-78
    4.2.1 复合表位免疫原在原核表达系统中的制备  77
    4.2.2 复合表位免疫原在毕赤酵母表达系统中的制备  77-78
    4.2.3 Asia1型FMDV衣壳蛋白在酵母中的共表达  78
  4.3 复合表位免疫原免疫途径与免疫效果的评价  78-82
    4.3.1 复合表位免疫原腹腔免疫效果评价  78-79
    4.3.2 黏膜免疫在FMDV防控中的意义  79
    4.3.3 以HBcAg为载体复合表位免疫原口服免疫效果评价  79-80
    4.3.4 复合表位免疫原滴鼻免疫效果的评价  80-82
5 结论  82-83
致谢  83-84
参考文献  84-98
攻读博士学位期间发表的学术论文  98

Asial型FMDV复合表位免疫原的研制及免疫效果研究

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