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透明颤菌血红蛋白结构与过氧化物酶活性关系的研究

作　者: 李伟
导　师: 李正强
学　校: 吉林大学
专　业: 生物物理学
关键词: 透明颤菌血红蛋白过氧化物酶活性单体-二聚体转变突变
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是一个来源于专性好氧的Vitreoscilla中的细菌球蛋白。VHb被认为具有维持细胞内氧溶解溶度水平的功能。如今，它已经在生物技术方面成为多功能的工具，特别是对于大规模的发酵和在培养过程中的氧气供应短缺，均可利用VHb的异源表达来解决，特别是在缺氧条件下可以提高细胞的生长和增殖。因此，VHb技术已应用于许多有价值的化合物的工业规模生产。VHb除了具有送输氧的功能，还一直参与细胞内的各种活动，如蛋白质翻译，细胞的新陈代谢以及降低亚硝化应激反应。VHb是第一个被发现的细菌血红蛋白，其结构和功能已被广泛研究。最初提出，在限制氧的条件下，诱导VHb与氧气结合并将其转运给终端呼吸氧化酶，以至于在限制氧的条件下保持较高水平的有氧呼吸。最近研究发现VHb具有过氧化物酶活性的性质。稳态动力学研究显示，VHb可以像辣根过氧化物酶一样催化各种芳香族类的底物。因此，VHb作为新发现的过氧化物酶，工业生产中具有更大应用价值。然而，VHb的催化活性似乎不是很高，这是由其活性位点的性质决定的。辣根过氧化物酶是一种常用的过氧化物酶，并且其过氧化物酶活性非常高。与辣根过氧化物酶相比，VHb缺少重要的催化残基端组氨酸，这也许可以解释为什么VHb的催化活性较低。在本实验中，为研究VHb生理功能与分子作用机制，我们构建了VHb的表达体系，通过控制环境中氧的浓度对VHb进行低氧诱导表达，并且对纯化条件改造与探索，通过分离纯化获得了较纯的VHb。透明颤菌血红蛋白表达载体的构建，包括目的基因与启动子的连接，重组质粒的构建。载体构建的设计为不含组氨酸标签的野生型蛋白vgb基因，与VHb的天然启动子共同连接到表达型载体pUC19中。研究表明vgb基因只有在其天然启动子的启动下才能开启目的基因的转录和翻译，使用不含组氨酸标签和任何突变的vgb基因，可以保证VHb在天然的生理环境中表达，研究VHb在胞内的真实生理功能。将已得到的重组质粒转入E. coli BL21(DE3)中，通过探索和改造重组菌的诱导表达及分离纯化，得到了SDS-PAGE一条带，Rz>3的目的蛋白。利用动态光散射技术研究了pH诱导下的VHb结构变化。实验结果表明，在中性条件下，VHb的分子大小为4.1nm，在酸性条件下其分子大小是5.9nm，而在碱性条件下其分子大小变为6.8nm。这说明，在pH7.0的中性条件下VHb表现出的是单体状态，而在pH6.0和8.0条件下，VHb分别形成两个不同的同源二聚体。使用生物膜干涉技术研究VHb两个亚基之间的相互作用力，测得的解离常数数据表明，在pH7.0时，VHb的单体与单体之间的解离常数(KD=6.34μM)是弱酸性条件下(KD=1.05μM)的6倍以及是弱碱性条件下(KD=1.22μM)5倍。这说明在中性条件下VHb两个亚基之间的作用力较弱，更容易形成单亚基，而在酸性或碱性条件下，VHb两个亚基之间的作用较强，更容易形成二聚体，这在动态光散射数据上表现为溶液中分子体积增大。pH诱导下的紫外吸收光谱数据显示，当pH值从6.0变化到8.0，VHb的最大紫外吸收峰从402nm变化到407nm，说明VHb的血红素微环境对pH值的变化非常敏感。此外，荧光数据显示，在激发波长为295nm的条件下，中性条件下荧光强度最强，而向酸性或碱性条件变化时其荧光强度在减弱。这是因为VHb只含有一个色氨酸，当形成二聚体状态时由于荧光量子产率的降低表现为荧光强度的减弱。然而，VHb的圆二色性光谱数据并没有明显差异，这说明pH的改变并没有改变VHb的二级结构。综上所述，VHb不仅仅是一个同源二聚体蛋白质，其在pH值为中性条件下是以单体状态存在的，而这种状态改变不伴随着其二级结构和三级结构上的改变。在本试验中还研究了VHb的pH依赖的过氧化物酶活性，使用2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)作为其催化底物，实验数据显示，在pH7.0条件下其过氧化物酶活性最高，说明VHb的最适pH为7.0，而这意味着VHb在单体状态下会表现出更好的过氧化物酶的活性。过氧化物酶具有降解纺织染料的能力是众所周知的，而VHb也是具有过氧化物酶活性的，因此VHb依然具有降解纺织染料的能力。为了研究VHb的脱色能力，在VHb远端口袋引入了两个可提高过氧化物酶活性的氨基酸残基组氨酸和半胱氨酸。利用定点突变技术构建出了三个VHb的突变体，分别是Q53H，P54C和Q53H/P54C。使用亚甲基蓝这一具有代表性的纺织染料作为底物研究VHb和其突变体对纺织染料的去除能力。对亚甲基蓝的脱色实验表明，突变体Q53H/P54C表现出了最高的去除效率的，在5min的接触时间内去除效率达到了70%，而野生型VHb在5min内对亚甲基蓝的去除率只有40%，突变体Q53H的去除效率略低于野生型VHb，突变体P54C的去除效率略高于野生型。因此，我们成功的筛选出了一个催化能力较强的VHb突变体。紫外光谱数据表明，Q53H/P54C的卟啉周围环境发生了改变，其紫外吸收峰变为413nm。而圆二色性光谱数据显示，Q53H/P54C的二级结构更加稳定。利用差示热量扫描仪对突变体的热稳定进行研究，结果显示，Q53H/P54C的变性温度达到了92.3℃，这说明其耐热性更高，而更适合工业上比较苛刻的条件。因此，我们筛选出了一个对纺织染料去除能力更高的VHb突变体Q53H/P54C，并且其可以在工业上应用更广泛的过氧化物酶类的蛋白质，并且具有更高的耐热性和更稳定的结构。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-15
英文缩写词  15-16
第1章绪论  16-38
  1.1 透明颤菌血红蛋白简介  17-20
    1.1.1 透明颤菌概述  17-18
    1.1.2 透明颤菌血红蛋白简介  18-19
    1.1.3 透明颤菌血红蛋白的结构特性  19-20
  1.2 透明颤菌血红蛋白的生物学功能  20-28
    1.2.1 透明颤菌血红蛋白的氧结合功能  20-21
    1.2.2 利用透明颤菌血红蛋白突变体研究其结构与功能  21-23
    1.2.3 透明颤菌血红蛋白与配体的相互作用特性  23
    1.2.4 透明颤菌血红蛋白调控基因表达的特性  23-26
    1.2.5 透明颤菌血红蛋白对生物体代谢的影响  26-27
    1.2.6 透明颤菌血红蛋白的过氧化物酶功能  27-28
  1.3 透明颤菌血红蛋白的基因工程应用  28-31
    1.3.1 透明颤菌血红蛋白在生物降解上的应用  28-30
    1.3.2 透明颤菌血红蛋白在生产工业上的应用  30-31
  1.4 蛋白质研究中的实验技术  31-38
    1.4.1 动态光散射在蛋白质研究中的应用  31-33
    1.4.2 生物膜干涉技术在蛋白质中的应用  33-34
    1.4.3 圆二色性光谱在解析蛋白质结构中的应用  34-36
    1.4.4 荧光光谱在蛋白质构象研究中的应用  36-38
第2章透明颤菌血红蛋白的表达及纯化  38-54
  2.1 实验仪器、材料和试剂  38-41
    2.1.1 实验仪器  38-39
    2.1.2 实验材料  39
    2.1.3 实验试剂  39-41
  2.2 实验方法  41-46
    2.2.1 实验流程  41-42
    2.2.2 建立透明颤菌血红蛋白表达菌株  42-44
      2.2.2.1 重组质粒转入大肠杆菌  42-43
      2.2.2.2 质粒提取及验证  43-44
    2.2.3 透明颤菌血红蛋白的表达  44-45
    2.2.4 透明颤菌血红蛋白的纯化  45-46
      2.2.4.1 破碎大肠杆菌细胞  45
      2.2.4.2 硫酸铵盐析  45
      2.2.4.3 离子交换层析  45
      2.2.4.4 凝胶过滤层析  45-46
      2.2.4.5 SDS-PAGE  46
      2.2.4.6 紫外可见吸收光谱  46
      2.2.4.7 还原态样品制备  46
  2.3 实验结果与讨论  46-52
    2.3.1 表达菌体的构建及验证  46-47
    2.3.2 透明颤菌血红蛋白的表达  47-48
    2.3.3 两次硫酸铵沉淀  48-49
    2.3.4 离子交换层析  49-50
    2.3.5 凝胶过滤层析  50-51
    2.3.6 透明颤菌血红蛋白纯度与分子量检测  51-52
    2.3.7 还原态透明颤菌血红蛋白的制备  52
  2.4 小结  52-54
第3章 PH 依赖下的透明颤菌血红蛋白结构改变对酶活性的影响  54-68
  3.1 实验方法  54-55
    3.1.1 动态光散射方法测定透明颤菌血红蛋白分子大小  54
    3.1.2 两个亚基之间的相互作用力  54-55
    3.1.3 圆二色性光谱的测定  55
    3.1.4 荧光光谱的测定  55
    3.1.5 过氧化物酶活性  55
  3.2 实验结果  55-66
    3.2.1 动态光散射分析 VHb 分子的大小  55-58
    3.2.2 pH 依赖的单体-二聚体结构的改变  58-62
      3.2.2.1 pH 依赖的 VHb 自身相互作用性质  58-60
      3.2.2.2 pH 依赖的 VHb 荧光发射光谱  60-61
      3.2.2.3 pH 依赖的 VHb 圆二色性光谱  61-62
      3.2.2.4 pH 依赖的紫外吸收光谱  62
    3.2.3 单体表现出具有最高的过氧化物酶活性  62-64
    3.2.4 VHb 同源二聚体的两种模型推测  64-66
  3.3 小结  66-68
第4章透明颤菌血红蛋白及其突变体对亚甲基蓝的脱色作用  68-84
  4.1 试验方法  68-72
    4.1.1 突变体的构建  68-71
      4.1.1.1 引物设计  68
      4.1.1.2 利用 PCR 技术建立突变表达载体  68-69
      4.1.1.3 PCR 产物的纯化及模板去除  69-70
      4.1.1.4 突变质粒转入大肠杆菌  70
      4.1.1.5 质粒提取及验证  70-71
    4.1.2 突变体的表达与纯化  71
    4.1.3 亚甲基蓝的降解  71-72
    4.1.4 圆二色性光谱的测定  72
    4.1.5 荧光光谱的测定  72
    4.1.6 蛋白质热稳定性的检测  72
  4.2 实验结果  72-82
    4.2.1 VHb 突变体的构建  72-74
    4.2.2 VHb 突变体的纯化  74-75
    4.2.3 野生型 VHb 对纺织染料的漂白作用  75-76
    4.2.4 VHb 突变体对纺织染料的漂白作用  76-78
    4.2.5 紫外吸收光谱性质  78-79
    4.2.6 VHb 突变体的结构分析  79-82
  4.3 小结  82-84
第5章总结  84-86
参考文献  86-102
攻读博士学位期间发表的论文  102-104
致谢  104

透明颤菌血红蛋白结构与过氧化物酶活性关系的研究

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