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腺病毒介导的siRNA沉默β-catenin对人羊膜间充质干细胞增殖的影响

作 者: 张东丽
导 师: 张一折
学 校: 郑州大学
专 业: 生物工程
关键词: RNA干扰 重组腺病毒 β-catenin AMSC 细胞增殖
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 21次
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内容摘要


目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)标记、β-连环蛋白(β-catenin)特异的RNAi重组腺病毒表达载体,利用包装好的重组腺病毒感染羊膜间充质干细胞(AMSC),在转录后水平有效的抑制β-catenin的表达,探讨siRNA干扰(β-catenin对AMSC增殖的影响。方法利用脂质体将设计合成好的三个β-catenin siRNA干扰片段瞬时转染AMSC,利用免疫印迹(Western Blot)筛选最优的β-catenin siRNA干扰片段;然后编码针对最优干扰片段,即CTNNB1短发卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)的单链DNA,并通过退火反应获得目的基因双链DNA,将目的基因连接至腺病毒穿梭质粒中构建阳性重组质粒pAdTrack-si-β-catenin,经PmeI酶切线性化后使其在BJ5183菌中与腺病毒骨架质粒进行同源重组从而获得重组腺病毒载体pAd-si-β-catenin,利用脂质体将经Pac I酶切线性化后的重组腺病毒质粒转染至HEK293细胞,包装重组腺病毒、空斑实验测定病毒滴度。重组腺病毒感染AMSC, Western Blot法检测AMSC中β-catenin及GSK-3β的表达情况,CKK-8法检测β-catenin沉默表达对AMSC增殖的影响。结果1. β-catenin siRNA干扰片段瞬时转染AMSC可以有效抑制β-catenin的表达,通过Western Blot成功的筛选出了最优的目的基因靶序列,设计并合成了shRNA的DNA双链,并成功构建出重组腺病毒表达载体p Ad-si-β-catenin;成功的包装、扩增出重组腺病毒,获得高滴度重组腺病毒。2.重组腺病毒感染AMSC后,在荧光倒置显微镜下可以观察到GFP表达,通过Western Blot检测到重组腺病毒感染AMSC后可以有效的抑制β-catenin基因的表达,感染组β-catenin明显少于对照组。3.重组腺病毒感染AMSC后,通过CKK-8法检测细胞生长曲线,与对照组相比,感染组细胞的增殖受到明显抑制。结论构建的特异RNAi重组腺病毒能够有效的抑制β-catenin基因的表达,减少了细胞内β-catenin的水平,且β-catenin的沉默表达可以明显抑制AMSC的增殖。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
符号说明  8-11
1 引言  11-16
  1.1 阿尔茨海默病  11
  1.2 羊膜间充质干细胞  11-12
  1.3 经典WNT信号通路  12-13
  1.4 RNA干扰  13-16
2 抑制β-catenin基因表达的siRNA重组腺病毒载体的构建  16-39
  2.1 材料与方法  16-30
    2.1.1 材料  16-18
    2.1.2 方法  18-30
  2.2 结果  30-37
    2.2.1 β-catenin siRNA瞬时转染AMSC的有效性  30-31
    2.2.2 重组腺病毒穿梭载体的构建  31-33
    2.2.3 重组腺病毒表达载体的构建  33-35
    2.2.4 HEK293细胞包装并扩增pAd-si-β-catenin-GFP重组腺病毒  35-37
  2.3 讨论  37-38
  小结  38-39
3 沉默表达β-catenin对羊膜间充质干细胞增殖的调控作用  39-46
  3.1 材料与方法  39-41
    3.1.1 材料  39-40
    3.1.2 方法  40-41
  3.2 结果  41-44
    3.2.1 pAd-si-β-catenin重组腺病毒感染AMSC  41-42
    3.2.2 Western Blot分析AMSC中β-catenin与GSK-3β表达状况  42-43
    3.2.3 pAd-si-β-catenin重组腺病毒感染AMSC后细胞生长曲线的测定  43-44
  3.3 讨论  44-45
  小结  45-46
结论  46-47
参考文献  47-51
附录  51-52
致谢  52-53
个人简历  53

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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