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基于纳米材料荧光淬灭作用的microRNA检测新方法研究

作　者: 屠蕴秋
导　师: 蔡称心
学　校: 南京师范大学
专　业: 生物物理化学
关键词: microRNA 荧光检测 金纳米粒子 氧化石墨烯 限制性内切酶
分类号: Q522
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


MicroRNAs (miRNAs)是一类长度为18-25个碱基的非编码小分子RNA。在生物体中,miRNAs通过与目标信使RNA (mRNA)3’端非翻译区结合使得mRNA降解或抑制其翻译,进而影响基因的表达。研究表明,癌症和肿瘤的发生及治疗过程中均伴随有miRNAs的异常表达,因此,miRNAs可作为生物标志物用于癌症的诊断、预后及预测,并可作为治疗靶点用于新型药物研究。发展可对其进行定性定量检测的检测方法成为基础生物医学研究中亟需解决的问题。本论文旨在建立针对miRNA的荧光检测新方法,为某些疾病的临床诊断提供快速、准确和灵敏的方法。本论文所建立的方法可准确检测细胞内miRNA表达量,在与miRNA相关的癌症早期诊断中有潜在应用前景。主要内容如下：1.建立了一种基于金纳米粒子荧光淬灭作用的microRNA检测方法。该方法是将荧光指示分子FITC标记的发夹型DNA探针的3’端通过Au-S键固定在AuNPs表面,与目标序列进行杂交,根据杂交前后FITC荧光信号的变化进行检测。研究结果表明,FITC荧光信号恢复的幅度与miR-122的浓度对数值在0.05-50pmol/L范围内呈线性关系,最低检测限为0.01pmol/L (S/N=3).并且,该方法能灵敏地区分完全配对和单碱基错配的目标序列,具有良好的特异性选择能力,在单核苷酸多态性研究方面有潜在应用前景。另外还可准确可靠地检测实际样本中的miRNA含量,在生物医学研究和临床早期诊断中有潜在应用价值。2.发展了一种基于氧化石墨烯荧光淬灭作用的microRNA检测方法。该方法中使用了一种包括用于与GO作用的结合区域(44nt)与用于与目标杂交的感应区域(22nt)的特殊单链DNA探针,探针吸附于GO表面,与目标cDNA进行杂交,然后经限制性内切酶RsaI剪切,根据FAM荧光信号在剪切前后的变化进行检测。结果表明,剪切前后FAM的荧光强度变化值与目标cDNA浓度对数值在0.02pmol/L到100pmol/L范围内具有良好的线性关系,信噪比为3时最低检测限为5fmol/L。并且,该方法能灵敏地区分完全配对和单碱基错配的目标序列,具有良好选择性。另外,该方法可以用于细胞中miR-126含量的快速检测,包括HMVEC、H226、A549、H358、MCF-10A和MDA-MB231细胞等。该方法可避免由于非特异性吸附干扰物而产生虚假信号,有望用于快速检测组织和细胞中作为生物标志物的miRNA含量,在生物医学研究和临床早期诊断中有潜在应用价值。

全文目录


中文摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-8
第1章 绪论  8-21
  1.1 引言  8
  1.2 MicroRNAs概述  8-16
    1.2.1 MicroRNAs的生物学意义  9-10
    1.2.2 MicroRNAs检测方法  10-15
    1.2.3 MicroRNA检测在诊断和治疗中的应用  15-16
  1.3 纳米材料及其在生物检测中的应用  16-19
    1.3.1 金纳米粒子及其应用  17-18
    1.3.2 氧化石墨烯及其应用  18-19
  1.4 论文的指导思想  19-21
第2章 基于金纳米粒子荧光淬灭作用的microRNA检测方法研究  21-31
  2.1 引言  21-22
  2.2 实验部分  22-25
    2.2.1 试剂  22
    2.2.2 仪器  22
    2.2.3 金纳米粒子(AuNPs)的制备  22-23
    2.2.4 AuNPs表面探针DNA的固定  23-24
    2.2.5 杂交  24-25
    2.2.6 细胞培养  25
    2.2.7 细胞提取物的制备  25
  2.3 结果与讨论  25-30
    2.3.1 检测原理  25-26
    2.3.2 杂交  26-28
    2.3.3 选择性研究  28-29
    2.3.4 实际样本检测  29-30
  2.4 结论  30-31
第3章 基于氧化石墨烯荧光淬灭作用的microRNA检测方法研究  31-44
  3.1 前言  31-33
  3.2 实验部分  33-36
    3.2.1 试剂  33-34
    3.2.2 GO的制备  34-35
    3.2.3 miRNA荧光分析  35
    3.2.4 细胞培养  35
    3.2.5 细胞提取物的制备  35-36
    3.2.6 仪器  36
  3.3 结果与讨论  36-42
    3.3.1 GO荧光淬灭能力分析  36-37
    3.3.2 杂交和RsaI剪切  37-40
    3.3.3 选择性研究  40-41
    3.3.4 实际样本检测  41-42
  3.4 结论  42-44
参考文献  44-57
在读期间发表的学术论文及研究成果  57-58
致谢  58

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 核酸 > 核糖（醣）核酸（RNA）
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