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KIFC1和KIFC3在中国石龙子精子发生过程中的表达模式及作用分析

作　者: 刘梅
导　师: 胡健饶
学　校: 杭州师范大学
专　业: 动物学
关键词: 精子发生 ec-KIFC1 ec-KIFC3 中国石龙子顶体复合体细胞核精子尾部
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

中国石龙子(Eumeces chinensis)属于爬行纲(Reptilia)、有鳞目(Squamata)、石龙子科(Scincidae)、石龙子属(Eumeces),主要分布在我国南部和越南,常被用作实验研究的模式动物。本文采用基凶克隆、HE染色法和原位杂交等技术研究了中国石龙子kifc1和kifc3基因序列、蛋白结构、不同组织表达特征及其在中国石龙子精子发生过程中的时空表达模式,探讨了kifc1和kifc3在中国石龙子精子发生过程中可能具有的功能,为进一步研究其在精子发生过程中的分子机制提供了科学依据。1.ec-kifc1和ec-kifc3基因序列、蛋白结构及不同组织表达特征我们通过降落PCR、巢式PCR及RACE从中国石龙子精巢中分别克降出与哺乳动物同源的KIFC1和KIFC3蛋白类似基因ec-kifc1和ec-kifc3。ec-KIFC1cDNA序列全长为2339bp,包括216bp的5’非翻译区、194bp的3’非翻译区和1929bp的开放阅读框,可以翻译643个氨基酸。ec-KIFC3cDNA伞长为3033bp,包括260bp的5’非翻译区、445bp的3’非翻译区和2328bp的开放阅读框,可以翻译775个氨基酸。蛋白结构预测显示,它们由头部、颈部及尾部组成,羧基末端的马达结构较为保守,包括ATP结合位点和微管结合位点。构建的系统进化树结果显示,它们和脊椎动物红原鸡的亲缘关系最近。通过RT-PCR技术研究发现ec-kifc1和ec-kifc3在所有检测的组织中都有表达,表达量不同,其中它们在精巢中的表达最丰富。由此我们可以推测ec-kifc1和ec-kifc3在中国石龙子精巢中发挥着重要作用。2ec-kifc1和ec-kifc3mRNA在中国石龙子精子发生过程中的时空表达模式及其作用通过免疫组化和原位杂交技术研究ec-kifc1和ec-kifc3mRNA在中国石龙子精子发生过程中的分布特征。精子发生早期,细胞核呈圆形,在细胞核近端形成一个大而透明的前顶体囊泡,ec-kifc1和ec-kifc3mRNA信号较弱,分布在核膜周围及细胞核内。精子发生中期,细胞核呈椭圆形,在细胞核近端形成含有顶体颗粒的顶体囊泡。在细胞核远端,中心粒和形成尾部的轴丝开始出现,ec-kifc1和ec-kifc3mRNA信号逐渐变强,主要分布在顶体囊和细胞核内,而ec-kifc1mRNA在尾部也有少量分布。在精子发生晚期,核内染色质浓缩成短丝状的染色质纤维,细胞核纵向延伸,体积变小,顶体复合体沿核膜延伸,ec-kifc1和ec-kifc3mRNA信号仍很强,主要分布在顶体复合体和细胞核内。精子成热期,精核浓缩到最大程度,整个精子细胞呈蝌蚪状,ec-kifc1和ec-kifc3mRNA信号变弱,零星的分布在顶体复合体上,而ec-kifc1mRNA在精核尾部仍有微弱的信号表达。由此可见ec-kifc1和ec-kifc3mRNA在中国石龙子精子发生过程中主要分布在顶体复合体和细胞核上,它们可能参与了顶体复合体的发育和细胞核的形态构建。另外,ec-kifc1和ec-kifc3mRNA在中国石龙子精子发生过程中同一时期精细胞上共定位,它们在上述细胞学事件中可能具有相互协作的功能。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章文献综述  9-19
  1.1 驱动蛋白及其作用的研究进展  9-12
    1.1.1 驱动蛋白分子的结构  9
    1.1.2 驱动蛋白的运动及物质运输机制  9-11
    1.1.3 驱动蛋白在物质运输中的作用  11
    1.1.4 疾病发生和驱动蛋白功能异常的联系  11-12
  1.2 驱动蛋白在精子发生过程中的作用  12-14
    1.2.1 精子发生的一般过程  12-13
    1.2.2 微管参与的精子发生  13
    1.2.3 精子发生过程中涉及的驱动蛋白  13-14
  1.3 爬行动物精子发生过程的研究  14-19
    1.3.1 雄性生殖器官结构  14-15
    1.3.2 精巢发育的分期  15-16
    1.3.3 精子形成过程中时期的划分  16-17
    1.3.4 精子的超微结构  17
    1.3.5 精子的储存  17-19
第二章驱动蛋白KIFC1和KIFC3在中国石龙子精子发生过程中的作用  19-67
  2.1 引言  19-20
  2.2 实验材料和仪器  20-23
    2.2.1 实验动物  20-21
    2.2.2 实验试剂  21-22
    2.2.3 实验仪器  22-23
  2.3 实验方法  23-42
    2.3.1 中国石龙子精巢ec-kifc1和ec-kifc3 cDNA的克隆  23-34
    2.3.2 PCR基因产物电泳检测、回收和纯化  34-35
    2.3.3 PCR产物与载体连接和克隆检测  35
    2.3.4 克隆载体转化和检测  35-36
    2.3.5 cDNA序列和蛋白预测结构的分析  36
    2.3.6 ec-KIFC1和ec-KIFC3组织特异性表达(RT-PCR分析)  36-37
    2.3.7 原位杂交  37-41
    2.3.8 精巢组织切片观察  41-42
  2.4 实验结果  42-61
    2.4.1 ec-KIFC1和ec-KIFC3 cDNA和蛋白质序列  42-47
    2.4.2 ec-KIFC1和ec-KIFC3蛋白多序列比对和进化分析  47-52
    2.4.3 ec-KIFC1和ec-KIFC3蛋白结构预测  52-54
    2.4.4 ec-KIFC1和ec-KIFC3组织特异性表达  54-56
    2.4.5 ec-KIFC1和ec-KIFC3在中国石龙子精子发生过程中的时空表达  56-60
    2.4.6 ec-KIFC1和ec-KIFC3序列的一致性  60-61
  2.5 讨论  61-65
    2.5.1 ec-KIFC1和ec-KIFC3基因序列和结构特点  61-62
    2.5.2 ec-KIFC1和ec-KIFC3在不同组织中的表达特点  62-63
    2.5.3 ec-KIFC1和ec-KIFC3在精子发生过程中的作用  63-65
  2.6 本章总结  65-66
  2.7 展望  66-67
参考文献  67-74
附录  74-75
致谢  75

KIFC1和KIFC3在中国石龙子精子发生过程中的表达模式及作用分析

内容摘要

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