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四倍体补偿法提高牛体细胞克隆效率的研究

作　者: 吕鑫
导　师: 王宗礼
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 四倍体胚胎 电融合 总细胞数计数 倍性分析 2n/4n嵌合体
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 8次
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内容摘要


四倍体补偿技术是由于四倍体与二倍体在胚胎发育中不随机分布，生成的嵌合体能使二者发育潜能的到补偿，从而提高体细胞克隆出生率的一种技术。本实验制备牛的四倍体胚胎并对四倍体囊胚进行检测，选择8-细胞期胚胎与体细胞克隆8-细胞或内细胞团聚合获得牛2n-4n嵌合体胚胎。其研究结果如下：1、精卵共孵育的受精卵移入到mCR1aa培养液中开始计时，统计不同时刻胚胎至2-细胞期时的卵裂率，选择胚胎处于2-细胞期数量最大的时间为四倍体胚胎制备的时间。结果发现14h时2-细胞期胚胎数目最多（46.28±8.64%），因此选择14h为制备四倍体胚胎的最佳时间。2、选用电融合的方法进行四倍体胚胎的制备。结果显示，100v/mm，20μs，1个脉冲的组合在四倍体胚胎存活率（93.71±5.31%）、融合后发育率（70.37±7.07%）、囊胚率（19.44±3.62%）上显著高于其他两个组合（P<0.05），而在胚胎融合率上与90v/mm，20μs，2个脉冲没有显著差异（P>0.05）。离子霉素＋6DAMP激活组与普通体外受精组相比在卵裂率（43.30±6.27%vs53.98±14.97%）和囊胚率（4.92±1.12%vs7.14±3.32%）上没有显著差异。因此选择100v/mm，20μs，1个脉冲组合且不进行激活处理作为制备四倍体胚胎的参数。3、选用mCR1aa培养液培养四倍体胚胎并通过体式镜观察牛四倍体胚胎发育的能力，结果显示牛四倍体胚胎具有发育到囊胚并扩张的能力，但囊胚率（19.44±3.62%）显著低于普通体外受精的囊胚率（21.77±5.75%）（P<0.05）。4、用总细胞数染色与囊胚细胞凋亡分析检测囊胚质量。与体外受精组（157.6±26.09）相比四倍体总细胞数较少（101.6±13.65），四倍体囊胚凋亡数（35±8.5）显著多于二倍体囊胚（14±4.5），说明囊胚质量较差。选取15枚四倍体囊胚进行染色体倍性分析，得知所生产的囊胚为四倍体囊胚（2n=120）。5、选用兔抗牛全血清与豚鼠补体共同作用溶解滋养层细胞来制备体细胞克隆胚胎的内细胞团。并选用内细胞团进行嵌合体的制备。克隆胚胎8-细胞或内细胞团与四倍体8-细胞相互嵌合，发育得到嵌合体。结果显示，用克隆胚胎8-细胞与四倍体8-细胞进行嵌合可以得到嵌合体的囊胚，囊胚率为15.67±5.72%。

全文目录


摘要  3-4
Summary  4-8
第一章 ：文献综述  8-20
  一、体细胞克隆的发展现状  8-9
  二、目前体细胞克隆存在的问题  9-11
    2.1 克隆总效率低下  9
    2.2 胎盘肥大且功能异常  9-10
    2.3 克隆相关基因的异常表达  10-11
  三、导致体细胞克隆低下的原因  11-13
    3.1 胎盘功能性异常是胎儿发育失败的主要原因  11
    3.2 滋养层功能性缺陷导致胎盘异常  11-12
    3.3 重编程失败是导致克隆失败的重要因素  12-13
  四、提高体细胞克隆效率方法  13-15
    4.1 表观遗传修饰调控提高克隆效率  13-14
    4.2 四倍体补偿法提高克隆效率  14-15
  五、四倍体研究进展  15-16
    5.1 四倍体胚胎制备  15-16
    5.2 四倍体胚胎的发育  16
  六、2n/4n嵌合体胚胎研究进展  16-17
  七、体细胞克隆中滋养层发育相关基因的表达  17-18
  八、展望  18-19
  九、立题的目的和意义  19-20
第二章 四倍体胚胎的制备  20-31
  1 实验材料  20-24
    1.1 主要实验仪器  20-21
    1.2 主要试剂  21-24
  2 试验方法  24-25
    2.1 卵母细胞的采集与成熟培养  24
    2.2 体外受精  24-25
    2.3 培养时间的确定  25
    2.4 胚胎 2 细胞的融合  25
    2.5 四倍体胚胎的激活与培养  25
    2.6 统计分析  25
  3 结果与分析  25-28
    3.1 二倍体胚胎融合四倍体时间的选定  25-26
    3.2 融合参数确定  26-27
    3.3 融合后四倍体胚胎的激活  27
    3.4 融合后四倍体胚胎发育  27-28
  4 讨论  28-30
    4.1 2-细胞期胚胎融合四倍体时间的确定  28-29
    4.2 四倍体胚胎制备参数的确定  29
    4.3 四倍体胚胎融合后激活  29
    4.4 四倍体胚胎发育的情况  29-30
  5 小结  30-31
第三章 四倍体囊胚的检测  31-37
  1 实验材料  31-32
  2 实验方法  32-33
    2.1 四倍体囊胚细胞染色  32
    2.2 四倍体囊胚染色体倍型分析  32
    2.3 四倍体胚胎早期细胞的凋亡  32-33
  3 实验结果  33-35
    3.1 四倍体囊胚染色结果  33-34
    3.2 四倍体囊胚染色体倍型分析结果  34
    3.3 四倍体早期胚胎细胞的凋亡  34-35
  4 讨论  35-36
  5 小结  36-37
第四章 2n/4n嵌合体的生产  37-44
  1 主要试剂  37-38
  2 实验仪器  38
  3 实验方法  38-41
    3.1 体细胞克隆细胞的制备  38-40
    3.2 内细胞团的分离  40
    3.3 2n/4n嵌合体制备  40-41
  4 实验结果  41-42
    4.1 内细胞团的分离  41-42
    4.2 嵌合体胚胎制备  42
  5 讨论  42-43
  6 小结  43-44
全文结论  44-45
参考文献  45-51
致谢  51-52
导师简介  52-53
个人简介  53-55
附录  55

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛
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