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癌胚抗原和神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析试剂的研制

作　者: 贺安
导　师: 吴英松
学　校: 南方医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 光激化学发光免疫分析癌胚抗原神经元特异性烯醇化酶检测
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景及目的标记免疫学是将标记技术和免疫学技术相结合而建立起来的一门不断发展的综合学科,也是当代免疫分析的主流核心技术。利用标记免疫学原理建立的标记免疫分析技术具有灵敏度高、特异性强等优点,已被广泛应用于基础医学和临床医学领域。近年来,由于新原理、新技术的应用越来越广泛,标记免疫技术得到了一定的发展。目前最常用的标记免疫分析技术是酶联免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay, CLIA)、电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescent immunoassay, ECLIA)和时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)。但EIA、CLIA、ECLIA和’TRFIA在应用中存在着一些固有的缺陷：EIA酶容易失活,导致EIA的灵敏度不高,被标记物的空间结构易受到酶的大分子标记影响,使得EIA灵敏度的提高受到限制；CLIA影响因素较多,例如易受环境干扰,发光时间短,化学反应后样品只可检测一次,无法重复测量,并且为非开放性试剂,试剂价格高；ECLIA尽管有一定优势,但也为非开放性试剂,试剂价格高；TRFIA测量方式复杂,仪器成本及维修费用高,环境及样品中同位元素可导致本底受到干扰；另一方面,以上技术均有一共同的缺点：需通过洗涤分离结合标记与游离标记。因此,有必要开发出能避免以上缺陷的新型标记技术。由此光激化学发光免疫分析(Amplifiedluminescent proximity homogenous assay, AlphaLISA)技术应运而生。该技术起源于1994年发明的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术(Luminescent oxygen channeling immunoassay, LOCI),后美国PerkinElmer公司生产相关试剂(AlphaScreen(?))。作为近年兴起的新型定量均相免疫学检测技术,它克服了传统标记免疫学技术需洗涤分离结合标记与游离标记的缺点的同时,还克服了EIA稳定性差、CLIA及ECLIA无法重复测量及成本高等缺点。它结合激光技术、单线态氧半衰期短和纳米材料等优势,实现了在均相中进行反应的操作过程。光激化学发光免疫分析技术具有高通量、高灵敏度、不需分离结合标记与游离标记、无放射性污染、检测重复性好、操作简单、易于自动化、背景信号低等优势,已广泛应用于生物医学研究,代表了现在及未来分析检测技术的发展趋势。血清癌胚抗原(Carcino-embryonic antigen, CEA)为一种传统的广谱肿瘤标志物,一直受到广泛的研究。它属于胚胎期和胎儿形成期产生的胎儿癌性抗原。首先发现于胎儿体内和结肠癌组织,是由胎儿胃肠道上皮组织、胰腺和肝脏细胞合成的一种相对分子量约为200 KDa的复杂的可溶性糖蛋白。正常人组织内含量很低,但在胃肠道恶性肿瘤患者的血清中CEA含量明显升高。此外,在妇科肿瘤、肺癌及其他恶性肿瘤患者的血清中也有所升高。CEA虽然不能作为特异性指标诊断某种恶性肿瘤,但在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测及疗效评价等方面仍有重要的临床价值。本研究主要是研制癌胚抗原光激化学发光免疫分析试剂,探讨其用于临床检测的可行性。神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)是由αγ、γγ组成的肝糖分解酶,主要分布于神经元、神经内分泌细胞。在起源于神经外胚层或神经内分泌组织的肿瘤病人血清、脑脊液中NSE水平升高,其中患小细胞肺癌和神经母细胞瘤的患者尤为明显。目前NSE被认为是脑损伤(神经母细胞瘤、急性脑血管疾病、缺氧性损伤等)和小细胞肺癌的一项高特异性和高敏感性的生化指标,对小细胞肺癌病人和颅脑损伤病人的早期诊断、病情监测、疗效评价等有重要价值。本研究主要是研制神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析试剂,探讨其用于临床检测的可行性。方法：采用双抗体夹心法研制癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析试剂。1.受体微球与抗体连接：将0.2 mg抗体加入到带有滤膜的离心管中,以9000rpm离心8 min,用缓冲液(0.13 mol/L, pH 8.0 PBS)重复洗涤6次后,在抗体溶液中加入1 mg受体微球、10μL 25 mg/mL NaBH3CN(用上述PBS缓冲液配制)、1.25μL 10%Tween-20,用上述PBS缓冲液将体积补充到200μL,37℃振荡孵育48 h。加入10μL 65 mg/mL CMO(用0.8 M NaOH配制)封闭未结合位点,37℃振荡孵育1h后离心洗涤,得到已连接抗体的受体微球,调整受体微球浓度为5 mg/mL。2.生物素与抗体连接：将另一株1 mg抗体加入到带有滤膜的离心管中,以9000rpm离心8 min。用缓冲液(含0.1% NaN3的0.1 mol/L, pH 9.5 Na2CO3/NaHCO3)重复洗涤6次后,将50μl抗体溶液中加入5μl 22 mg/mL生物素中(用DMSO配制),室温振动孵育4 h。利用带有滤膜的离心管去除多余的生物素,并将其抗体浓度调整为0.5 mg/mL。3.参考标准品的制备：用标准品缓冲液将CEA抗原配制成0ng/mL、2ng/mL、5 ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL系列浓度,每瓶0.5 mL分装冻干,4℃保存备用；用标准品缓冲液将NSE抗原配制成0 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL、40ng/mL、200 ng/mL、600ng/mL系列浓度,每瓶0.5 mL分装冻干,4℃保存备用。4.试剂性能指标的评价4.1准确度实验：试剂参考标准品用相应浓度的国家标准品进行多次分析测定,并以CEA国家标准品为对照品,并以自制标准品的实测浓度与标示浓度的比值在0.90-1.10之间作为评价准确性合格的标准。4.2标准曲线的绘制：以自制试剂中参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值1×103计数的对数为纵坐标,由双对数数学模型Log-Log函数处理。4.3标准曲线工作范围及Hook效应：将参考标准品抗原稀释成不同浓度进行测定。4.4灵敏度实验：将零参考标准品当作样品测量20次,计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上2倍标准差所得信号值减去本底信号值,代入标准曲线方程计算所得出的浓度,即为其灵敏度。4.5回收率实验：将参考标准品中某一点按1：20加入到质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ之中,计算其理论值及实测值的比值,即回收率。4.6精密度实验：重复测定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个血清质控品各10次,得到各质控品检测值的均数、标准差及CV值。4.7特异性实验：将一定浓度的干扰物质作为样本检测得到的相应浓度即为特异性。4.8干扰性实验：对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的阳性标本进行测定,计算其回收率。4.9正常参考值范围：以自制的试剂检测健康人血清,统计其血清水平的分布情况。4.10与国外试剂的比较实验：样本用自制试剂与对照试剂检测后将所测浓度值进行阴阳性比较、配对非参数秩和检验及相关性分析。结果：以CEA国家标准品为对照品,试剂参考标准品实测浓度与标示浓度的比值在0.92-1.09之间；自制CEA试剂灵敏度为0.11 ng/mL,标准曲线工作范围为0-500 ng/mL;试剂分析内变异系数为3.30%-6.83%,分析间变异系数为5.52%-8.09%;与AFP (Alpha-fetoprotein)、CA125 (Cancer antigen 125)、CA19-9 (Cancer antigen 19-9)、人血清白蛋白无交叉反应；检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰；推荐CEA血清水平的正常参考值范围为0-6.5ng/mL;将100份血清标本用本试剂与国外罗氏电化学发光试剂同时检测,配对非参数秩和检验结果如下：Z=1.644,P=0.1>0.05,表明两试剂在检测CEA浓度上无统计学差异；进行相关性分析,其相关系数(r)为0.976。自制NSE试剂灵敏度为0.149 ng/mL,标准曲线工作范围为0-600 ng/mL;回收率为101.12%-105.27%；试剂分析内变异系数为3.70%-4.29%,分析间变异系数为3.90%-5.19%；与CYFRA21-1(Cytokeratin 19 fragment antigen).NNE (Non-neuronal enolase)无交叉反应；检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰；推荐NSE血清水平的正常参考值范围为0-16.5 ng/mL;将154份血清标本用本试剂与国外罗氏电化学发光试剂同时检测,进行配对非参数秩和检验,结果显示：Z=1.140,P=0.254>0.05,表明两试剂在检测血清中NSE上无统计学差异；进行相关性分析,其相关系数(r)为0.979。结论：上述结果表明本研究研制的癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析试剂的各项指标(准确性、灵敏度、精密度、特异性等)均达到临床检测试剂要求,有望替代国外昂贵试剂应用于临床检测和基础医学的研究。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
前言  15-25
第一章癌胚抗原(CEA)光激化学发光免疫分析试剂的研制  25-42
  1.1 材料  25-27
  1.2 方法  27-32
  1.3 结果  32-38
  1.4 讨论  38-40
  1.5 结论  40-42
第二章神经元特异性烯醇化酶(NSE)光激化学发光免疫分析试剂的研制  42-55
  2.1 材料  42
  2.2 方法  42-46
  2.3 结果  46-52
  2.4 讨论  52-54
  2.5 结论  54-55
参考文献  55-60
中英文缩略词  60-62
硕士期间论文发表情况  62-63
致谢  63-65
统计学证明  65

癌胚抗原和神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析试剂的研制

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