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低毒力病毒CHV1（Cryphonectria hypovirus 1）5’-端3个基因的克隆及板栗疫病生物防治

作　者: 叶云
导　师: 王克荣
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 栗疾菌 低毒力病毒 系统进化树 测序 生物防治 营养体不亲和性
分类号: S436.64
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 14次
引　用: 1次
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内容摘要


栗疫菌细胞中的低毒力病毒是一类没有衣壳的双链RNA病毒,可以引起寄主栗疫菌的菌落形态变化、分生孢子和色素的产量降低、雌性不育,和漆酶产量与活性降低。更重要的是,低毒力病毒的侵染会导致栗疫菌毒力的下降,这一发现为栗疫病的生物防治提供了一种全新的思路。目前已经报道了3个CHV1 (Cryphonectria hypovirus 1)的全基因组序列,这三个菌株的序列同源性非常高,然而本实验室对中国CHV1初步的测序结果发现中国的CHV1群体结构更为复杂。为了更好地研究中国的低毒力病毒,本文从更长的序列上分析了CHV1的多样性。首先,利用本实验室已全基因组测序的中国菌株CHV1-CN280,结合已发表的3株CHV1病毒,在序列保守区域设计了特异性的引物。然后基于RT-PCR技术,分4段克隆和测序了来自中国、日本和意大利共14株低毒力病毒的5’-端约3200bp序列。分析了这些序列中的5’-UTR(untranslated region, UTR)、p29、p40和p48的差异,同时利用这些序列分析了低毒力病毒的系统进化关系。实验结果表明,CHV1的5’-UTR和p29变异较大,根据这两者作的系统进化树较相似。并且发现CHV1-Ja19的p29蛋白在C-端存在自然缺失。p40在3个蛋白中最为保守,所作的系统进化树没有明确的分枝。p48在N-端有较大变异,而C-端则趋于保守。通过测序结果分析发现CHV1两个开放阅读框之间的重叠连接序列也具有多样性。中国北方的群体为八核苷酸序列AUGUAUAA,南方群体为五核苷酸序列UAAUG;在GenBank中的序列检索还新发现欧洲菌株中也有八核苷酸连接方式。比较不同蛋白的系统进化树发现,CHV1中普遍存在遗传重组现象。例如,CHV1-CN431、CHV1-CN238和CHV1-CHR011的5’-UTR和p29的N-端与中国北方菌株的亲缘关系更近,p48却与南方菌株的亲缘关系更近,CHV1-A1 30的情况则刚好相反；两个日本菌株的5’-UTR和p29与中国南方菌株亲缘关系非常近,但是p48的亲缘关系却很远,似乎有其它的来源。最后对所测序列的全长作系统进化分析可以看出,欧洲的CHV1病毒与中国北方的低毒力病毒群体处于一个分枝内,表明二者亲缘关系更近。本文另外报道了在浙江省遂昌县进行栗疫病生物防治所取得的阶段性成果。低毒力菌株在田间的定殖和传播较为困难,但是通过处理自然发病的病斑,可以将低毒力病毒引入板栗林中的栗疫菌群体,而且营养体不亲和性在田间对低毒力病毒的传播影响有限。考虑到中国栗疫菌复杂的遗传多样性,这对于中国果疫病的生物防治来说是个好消息,但是影响中国生物防治成败的其它因素还有待探索。

全文目录


中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
上篇 文献综述  10-23
  1 低毒力病毒的发现和分类  11-12
    1.1 低毒力病毒的发现  11
    1.2 低毒力病毒的分类地位和种类  11-12
  2 低毒力病毒基因组研究  12-14
    2.1 低毒力病毒的基因组结构  12-13
    2.2 低毒力病毒的基因功能研究  13-14
  3 低毒力病毒的群体多样性  14-15
    3.1 早期研究方法的成果  14-15
    3.2 测序方法的研究成果  15
  4 低毒力病毒用于生物防治  15-17
    4.1 生物防治的实践  15-16
    4.2 生物防治影响因素的探讨  16-17
  参考文献  17-23
下篇研究内容  23-53
  第一章 低毒力病毒5’-端测序与分析  25-45
    1 材料和方法  26-32
      1.1 材料  26-29
      1.2 方法  29-32
    2 结果和分析  32-39
      2.1 5’-端部分非编码区(384～495)  33
      2.2 p29序列分析(496～1239)  33-35
      2.3 p40序列分析(1240～2364)  35
      2.4 p48序列分析(2364～3617)  35-36
      2.5 CHV1两个开放阅读框的重叠连接方式  36-37
      2.6 基于低毒力病毒5’-端碱基序列的进化树分析(384～3617)  37-39
    3 讨论  39-41
    参考文献  41-45
  第二章 利用低毒力病毒防治板栗疫病  45-53
    1 材料和方法  46-49
      1.1 供试栗疫菌和低毒力病毒  46
      1.2 试验田  46
      1.3 栗疫菌的接种、采样、分离、纯化和营养体亲和群测定  46-47
      1.4 试验方案与小区设计  47-49
    2 结果和分析  49-50
      2.1 低毒力病毒在田间的定殖与传播  49
      2.2 营养体不亲和性对病毒田间传播的影响  49-50
    3 讨论  50-51
    参考文献  51-53
附录1 测序中使用的RT-PCR引物  53-55
攻读硕士学位期间发表的研究论文  55-57
致谢  57

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