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应用生物光谱技术研究细胞损伤和组织生长的生物分子特征性变化

作　者: 庞伟毅
导　师: 仇小强
学　校: 广西医科大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 衰减全反射-傅立叶变换红外光谱苯并芘细胞周期多变量分析 MCF-7细胞拉曼光谱鸡胚胎角膜
分类号: R318.0
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

生物各种组织和细胞都由蛋白质、核酸、脂类等生物分子组成,生物分子由于电子偶极矩化学键不同,因此每一种生物分子在生物光谱学上都有其特征性的振动谱带。细胞内生物分子成分和(或)构象发生变化,就会引起振动谱带精细的改变,而生物光谱技术如红外光谱技术、拉曼光谱技术可以精确检测和评价这些微观的变化,从而反映组织或细胞的生物分子的特征性变化。不同的生物光谱学技术,虽然其工作原理不尽相同,但都具有快速、客观、无创、重现性好等优点。由于生物光谱实验通常将采集涵盖复杂生物化学信息数据集的成百上千个图谱,而且这些图谱存在着很多的重叠性或只是细微的差异,因此对其图谱的分析最好应用多变量分析的方法,如主成份分析和/或线性判别分析。多变量分析不仅对原始数据进行了降维,判别组间差异,而且能够容易鉴别获取波数相关的生物标记物,如糖原含量、脂质含量、蛋白质构象变化和磷酸化作用以及DNA/RNA的结构改变。当前,与环境致癌物相关的肿瘤发病率呈不断上升趋势,准确地检测环境致癌物的人群暴露浓度以及研究其作用致癌机理,是预防和治疗癌症的重要任务之一。苯并芘是环境污染物中一种前畸变和前致癌物,是多环芳烃类化学物的典型代表。传统上,遗传毒性的短期评价实验通常检测的是高剂量(≥μmol/L)化学物的毒性,但根据这些实验结果发现的生物学效应,如何外推到与人群暴露背景水平相一致的低剂量污染物引起的生物学效应仍然是不明确的。因此,探讨能够有效评价低剂量环境化学物的毒性及其毒理学机制的方法是非常迫切的。本研究应用衰减全反射-傅立叶变换红外光谱技术探讨和研究低剂量苯并芘(最低剂量低至nmol/L级别)对不同周期(S期和Go/G,期)的靶细胞的生物学改变和其毒作用机理。正常组织生长的生物分子特征变化的研究,不仅能更好地深入理解组织成分结构-功能关系,也会为组织的病理改变的研究、疾病的预防与治疗提供更深的认识。本研究还同时利用衰减全反射-傅立叶变换红外光谱和拉曼光谱技术研究在鸡胚胎10-18天期间,以每间隔1天的短时间点内,持续追踪角膜生长、透明化过程中生物分子的微观改变。因此,不仅能够为更好地理解角膜生长过程中的结构-功能关系,也会为生物光谱技术用于正常组织学和病理学的研究提供新的视角。因此,本研究运用生物光谱技术(衰减全反射-傅立叶变换红外光谱和／或拉曼光谱技术)及对图谱的多变量分析方法探讨细胞损伤和正常组织发生的生物分子特征性变化,为探讨和评价细胞和组织的微观变化提供新的手段和视角。目的衰减全反射-傅立叶变换红外光谱(ATR-FTIR)是一种通过无创性方式,鉴别研究细胞生物分子特征性变化的全新技术方法。本研究运用ATR-FTIR光谱技术以及多变量分析研究不同剂量的B[a]P对不同周期的MCF-7乳腺癌细胞生化分子的影响。明确B[a]P的剂量-效应关系、不同浓度的B[a]P对不同周期的靶细胞毒作用方式、不同周期的MCF-7乳腺癌细胞对B[a]P的易感性以及细胞损伤的判别性生物标记物。为研究和评价低剂量环境污染物对靶细胞的综合生物学效应提供一种新的手段和方法。方法1.用空白对照(DMSO)(?)口系列浓度(10-9M,10-8M,10-7M,10-6M和10-5M)的B[a]P对S期或Go/G1期的MCF-7细胞进行染毒培养24小时,细胞经消化、洗涤、固定后应用ATR-FTIR对其检测。2.只用低剂量(109M)和高剂量(10-6M)的B[a]P对S期或Go/G1期的MCF-7细胞进行染毒观察其不同的诱导效应,细胞经消化、洗涤、固定后应用ATR-FTIR对其检测。3.采用主成份分析和线性判别分析(PCA-LDA)对获取的ATR-FTIR图谱进行变量分析。4.细胞(≈1.0×105/m1)接种培养24小时后,用低剂量(10-9M)、高剂量(10-6M)的B[a]P和空白对照(DMSO)对其进行染毒。在不同的时间点(0、12、24、48小时)细胞经洗涤、消化、重悬后用血球计数板进行细胞计数。结果1. PCA-LDA一维和二维得分图表明,不同浓度的B[a]P对不同周期MCF-7细胞都存在着剂量-效应关系。与对照组相比,较高浓度B[a]P处理组(10-6M或10-5M)的图谱点比低浓度处理组区分度更高、差异更明显。ANOVA检验结果表明所有的处理组与对照组相比,差异具有统计学意义(P≤0.001)。2.在实验Ⅱ中,无论是S期还是Go/G1期的MCF-7细胞,与对照组相比,一维和二维的得分图都表明高剂量的B[a]P与低剂量的B[a]P相比具有更明显的差异性、区分度更高。在S期,高剂量(10-6M)导致的主要生物学改变是DNA/RNA、脂质、蛋白质的二级结构(酰胺酶Ⅰ和酰胺酶Ⅲ)、脂肪酸和氨基酸；而低剂量(10-9M)导致的主要改变是蛋白质二级结构(酰胺酶Ⅰ、酰胺酶Ⅱ和酰胺酶Ⅲ)和脂质。然而,高剂量和低剂量的B[a]P引起Go/G1期MCF-7细胞图谱改变的区域都集中在蛋白质二级结构、DNA/RNA、脂肪酸和氨基酸的COO-键。3.MCF-7细胞暴露于高剂量(10-6M)、低剂量(10-9M)B[a]P和对照(DMSO)后,随着时间的改变而导致不同的生长动力学改变。处理12小时后,不同的处理组之间没有明显的差异；而24小时后,高浓度的B[a]P导致MCF-7细胞数目的急剧增加。然而,作用时间达到48小时后,高浓度的B[a]P引起细胞数目明显下降,而低剂量(10-9M)B[a]P与对照组相比,生长曲线基本类似。结论B[a]P可诱导不同周期MCF-7细胞产生明显的生物学改变,而且存在着剂量-效应关系；图谱改变的区域主要集中在DNA/RNA、蛋白质二级结构和脂质。红外线光谱技术及多变量分析方法为更好地研究低剂量环境污染物的生物学效应提供了一种全新的手段,该方法可以充分显示环境化学物引起的综合生物学效应。目的生物光谱技术越来越被公认为其是一种可以检测鉴别复杂生物结构特征性变化的崭新无创性工具。本研究应用生物光谱技术研究鸡胚胎角膜透明度从起始到生长发育各阶段生物分子的特征性变化。为更好深入理解角膜生长发育过程中的结构-功能关系,以及生物光谱技术应用于正常组织学和病理学的研究提供新的视角。方法在鸡蛋孵化期10天到18天期间,以每2天的间隔期(第10,12,14,16,18天),获取鸡胚胎眼角膜(n=46),并分别应用衰减全反射傅立叶红外光谱(ATR-FTIR)和拉曼光谱技术对其检测。采用主成份分析和线性判别分析(PCA-LDA)对获取的图谱进行变量分析。结果1. ATR-FTIR光谱和拉曼光谱在胚胎每个检测时间点的均值谱均有较大程度的重叠,但第10天的均值图谱DNA的信号强度明显增强(1080cm-1)；2.无论是ATR-FTIR光谱还是拉曼光谱,在PCA-LDA一维,二维或三维得分图中各个时间点的鸡角膜标本显著分离,间隔天数越大图谱点的交叉性越少,ANOVA检验结果表明其余检测时间点与角膜透明度起始时间点孵化期第10天相比,差异具有统计学意义(P≤0.001)；3.两分类的判别分析进一步清晰显示在角膜组织成熟的过程中分子特征性改变；4.在鸡角膜发育的第10天和18天两分类比较,ATR-FTIR光谱技术发现主要的生物标记物是DNA/RNA(1126cm-1),糖原(1045cm-1),蛋白质(1470cm-1)酰胺酶Ⅱ(1512cm-1和1524cm-1)；5.拉曼光谱研究也显示在鸡胚胎角膜组织成熟的过程中主要的生物标记物是蛋白质,氨基酸(酪氨酸,比咯氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸)和蛋白质的二级结构(酰胺酶Ⅰ和酰胺酶Ⅱ)。结论在鸡胚胎10-18天期间,生长发育的鸡角膜在生物分子成分上发生显著性变化,其在生物光谱图谱区域体现的主要改变是DNA/RNA,蛋白质,糖原和蛋白质二级结构。

全文目录

主要英文缩写  4-5
摘要  5-11
ABSTRACT  11-19
前言  19-22
第一部应用红外光谱技术及多变量分析研究苯并芘诱导不同细胞周期的MCF-7乳腺癌细胞的生物分子改变  22-57
  前言  22-27
  材料和方法  27-32
  结果  32-46
  讨论  46-49
  参考文献  49-57
第二部分应用生物光谱技术及多变量分析研究鸡胚胎角膜生长发育的生物分子特征性变化  57-85
  前言  57-59
  材料和方法  59-63
  结果  63-75
  讨论  75-78
  参考文献  78-85
总结  85-86
综述  86-98
  参考文献  94-98
致谢  98-99
攻读博士学位期间发表的学术论文  99-100

应用生物光谱技术研究细胞损伤和组织生长的生物分子特征性变化

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