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17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对心肌细胞离子通道作用的研究

作　者: 李映新
导　师: 黄仁彬
学　校: 广西医科大学
专　业: 药理学
关键词: KM小鼠 钙耐受 心室肌细胞 膜片钳 YLSC L型钙通道电流 钠通道电流 瞬时外向钾通道电流 内向整流钾通道电流 乳鼠心肌细胞 细胞内游离钙 激光扫描共焦显微镜
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


玉郎伞(YLS)为蝶形花科植物疏叶崖豆Millettia pulchra Kurz var. Laxior (Dunn)Z. Wei的干燥块根,近年来对其开展的研究发现：玉郎伞的黄酮总提物对缺血再灌注损伤有保护作用,并从黄酮总提物中分离得到一抗氧化活性较强的单体化合物,按其化学结构式命名为17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮(YLSC)。离体和在体的实验研究都证明：YLSC是YLS总黄酮的主要有效成分,能有效改善缺血和再灌注期间心脏的血流动力学异常,减少心肌酶渗出,改善心肌形态学的病理变化,其作用机制主要包括抗氧化、抑制细胞凋亡及减轻心肌钙超载。钙超载是缺血细胞再灌注损伤致死的“最后通路”,心肌细胞膜钙离子通道Ca2+的异常转运在钙超载的形成过程中起着关键作用,虽然以往也研究了Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、NCX等与Ca2+转运有关的机制,但并没有直接观察YLSC对钙离子通道的作用,此外,心肌细胞还有钠、钾通道等,和钙通道一起,它们的离子流的变化共同构成心肌细胞电活动,然而MIRI可以引起各种血流动力学的变化,其病理基础是心脏电活动的异常即主要为钠、钾、钙离子流的异常,在这一过程中能够纠正电活动异常或减轻其后果的因素都可能成为治疗手段。本实验采用膜片钳技术观察YLSC对昆明小鼠心室肌细胞膜上L型钙通道、钠通道及钾通道电流的作用,以及运用激光扫描共焦显微镜技术检测细胞内[Ca2+]i,以观察对H2O2诱导的乳鼠心肌细胞内钙超载的影响,以期为YLSC的研究提供更多的实验依据和理论基础。第一部分昆明小鼠心室肌细胞急性分离方法的探讨及电生理特征目的：建立简单实用的耐钙昆明小鼠心室肌细胞急性分离方法,并观察其电生理特征。方法：采用Langendoff灌流装置和酶解分离技术分离单个昆明小鼠心室肌细胞,采用两步灌流：先灌流无钙台式液,再灌流混合酶液,实验组在消化液灌流期间,每隔5min加入10μl的20mM CaCl2;对照组不加CaCl2,以流出液出现单个心肌细胞即刻停止消化,对比两组即刻分离的杆状心肌细胞得率及耐钙细胞得率,以全细胞膜片钳的电流钳和电压钳模式记录动作电位、L型钙通道电流,以考察细胞的电生理特性。结果：两组分离即刻所得杆状细胞得率相当,均在在70%以上,但实验组的耐钙细胞得率要明显高于对照组(P<0.05)。实验组细胞能记录到典型的小鼠心室肌动作电位及L型钙电流。结论：在一定范围内逐步提高消化液的钙浓度有助于提高耐钙心肌细胞的得率,所得细胞易于封接、破膜,具有正常的电生理特征,可作为膜片钳实验标本。第二部分17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对小鼠心室肌细胞L-型钙电流的影响目的：探讨17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮(YLSC)对小鼠心室肌细胞膜L-型钙电流的影响。方法：采用Langendoff灌流装置和酶解分离技术分离单个昆明小鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术记录YLSC对ICa-L的作用,RT-PCR检测对Cav1.2的基因表达的影响。结果：①200、400、600、800μmol.L-1YLSC的抑制百分比分别为(95.2±1.4)%、(67.8±2.3)%、(29.1±1.8)%、(8.2±1.1)%(n=5),EC50为508.4μmol.L-1.②YLSC可使最大锋电流幅值减少,Ⅰ-Ⅴ曲线上移,且能明显改变最大激活电位和翻转电位,使最大激活电位和翻转电位左移。③500μmol.L-1YLSC能使ICa-L的激活曲线和失活曲线左移,使得激活和失活电压降低,激活和失活的速率增加。④200、400μmol. L-1YLSC作用后的Cav1.2表达水平分别是空白对照组的0.72±0.12和0.38±0.05。结论：YLSC对ICa-L有浓度依赖性阻滞作用,该作用具有可逆性；能促进ICa-L的激活和失活过程,减少钙电流持续内流时间,能下调Cav1.2的基因表达。这可能是YLSC减轻心肌细胞内钙超载及负性肌力作用的电生理机制之一。第三部分17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对小鼠心室肌细胞钠电流的影响目的：探讨17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮(YLSC)对小鼠心室肌细胞膜钠电流的影响。方法：采用Langendoff灌流装置和酶解分离技术分离单个昆明小鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术记录YLSC对INa的影响。结果：①200、400、600μmol.L-1YLSC对INa有浓度依赖性阻断作用,其抑制百分比分别为(86.2±1.2)%、(52.4±3.6)%、(35.2±2.6)%(n=5),EC50为326.6μmol.L-1。②YLSC可使INa最大锋电流幅值减少,Ⅰ-V曲线上移,不改变最大激活电位和翻转电位。③400μmol. L-1YLSC对激活曲线没有显著影响,但能影响通道的失活过程,使失活电压下降。结论：YLSC对INa有浓度依赖性阻断作用,该作用具有可逆性；可促进INa的失活过程,加速INa的失活。这可能是YLSC抑制心肌内Na+-Ca2+交换减轻钙超载及改善缺血再灌注期间心率失常的电生理机制之一。第四部分17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对小鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流的影响目的：探讨17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮(YLSC)对小鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流的影响。方法：采用Langedoff灌流装置和酶解分离技术分离单个昆明小鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术记录YLSC对Ito的影响。结果：①200、400、800μmol.L-1YLSC对Ito有微弱的增强作用,但无统计学差别(n=5,P>0.05)。对Ito的电流-电压曲线、激活曲线亦无明显影响,但能够使半数失活电压升高,抑制Ito的失活。结论：YLSC对Ito没有影响,瞬时外向钾通道没有参与YLSC的电生理调节机制。第五部分17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对小鼠心室肌细胞内向整流钾电流的影响目的：探讨17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮(YLSC)对小鼠心室肌细胞膜内向整流钾电流的影响。方法：采用Langendoff灌流装置和酶解分离技术分离单个昆明小鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术记录YLSC对IK1的作用,RT-PCR检测对Kir2.1的基因表达的影响。结果：①200、400、800μmol.L-1YLSC对IK1的内向电流成分可明显减弱(n=5,P<0.05),有剂量依赖性；对IK1的外向电流成分虽然也可减弱,但与对照组比较无统计学差别(n=5, P>0.05)。②YLSC不改变IK1的Ⅰ-Ⅴ曲线形态,仍表现出内向整流特征,亦不改变反转电位。③200、400μmol.L-1YLSC作用后的Kir2.1表达水平分别是空白对照组的0.68±0.10和0.27±0.04。结论：YLSC浓度依赖性地抑制IK1的内向电流成分,主要影响细胞的静息膜电位,使心肌细胞兴奋性和自律性降低,下调Kir2.1的基因表达。这可能是YLSC具有负性频率作用的电生理机制之一。第六部分17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对乳鼠心肌细胞内游离钙的影响目的：探讨17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮(YLSC)对H202诱导钙超载的拮抗作用。方法：采用SD大鼠乳鼠进行心肌细胞培养。实验分为：(1)正常对照组：不加任何处理因素；(2)H2O2组：上机前加入终浓度为0.3mmol·L-1的H2O2;(3)YLSC干预组：预先给予低、中、高不同剂量YLSC孵育24h,上机前加入终浓度为0.3mmol·L-1H2O2。以Fluo-3/AM荧光指示剂负载,应用激光共聚焦显微镜技术,分别于加入H202后即刻和15min时检测[Cr2+]i的变化；RT-PCR检测对RyR2的基因表达的影响。结果：H2O2处理后心肌细胞[Ca2+]i明显上升,[Ca2+]i荧光强度增加百分数(%)为60.43%±7.75%,YLSC低、中、高三个浓度预处理后,[Ca2+]i均较H2O2组明显降低,[Ca2+]i荧光强度增加百分数(%)分别为38.39%±13.87%,14.49%±2.94%,-28.1%±1.52%,与模型组比较显著降低(P<0.01)；200、400μmol.L-1YLSC作用后的RyR2表达水平分别是空白对照组的0.14±0.06和0.02±0.01。结论：H2O2诱导心肌细胞钙超载,YLSC能通过抗氧化应激和下调RyR2的基因表达,显著减轻H2O2诱导心肌细胞钙超载。

全文目录


本文主要缩写符号说明  5-7
摘要  7-13
ABSTRACT  13-20
前言  20-23
  参考文献  22-23
第一部分 昆明小鼠心室肌细胞急性分离方法的探讨及电生理特征  23-41
  1 材料与仪器  23-27
  2 方法  27-31
  3 结果  31-35
  4 讨论  35-39
  参考文献  39-41
第二部分 17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对小鼠心室肌细胞L-型钙电流的影响  41-61
  1 材料与仪器  41-42
  2 方法  42-48
  3 结果  48-57
  4 讨论  57-59
  参考文献  59-61
第三部分 17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对小鼠心室肌细胞钠电流的影响  61-73
  1 材料与仪器  61-62
  2 方法  62-64
  3 结果  64-70
  4 讨论  70-71
  参考文献  71-73
第四部分 17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对小鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流的影响  73-82
  1 材料与仪器  73-74
  2 方法  74-75
  3 结果  75-80
  4 讨论  80-81
  参考文献  81-82
第五部分 17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对小鼠心室肌细胞内向整流钾电流的影响  82-95
  1 材料与仪器  82-83
  2 方法  83-84
  3 结果  84-90
  4 讨论  90-92
  参考文献  92-95
第六部分 17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮对乳鼠心肌细胞内游离钙的影响  95-105
  1 材料与仪器  95
  2 方法  95-96
  3 结果  96-101
  4 讨论  101-104
  参考文献  104-105
结论  105-106
展望  106-107
攻读博士学位第期间（待）发表的论文  107-108
综述一  108-114
  参考文献  111-114
综述二  114-132
  参考文献  128-132
致谢  132

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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