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腘窝淋巴结试验在TCMIs过敏性评价中的应用研究

作　者: 黄路芬
导　师: 王培训
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中西医结合基础
关键词: 过敏性评价中药注射剂不良反应腲窝淋巴结实验免疫细胞表面分子
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

随着中药注射剂(Traditional Chinese medicine Injections,TCMIs)临床应用范围的扩大,尤其是静脉给药的逐渐增多,其引起不良反应的报道也逐年增加,且主要是免疫介导药物超敏反应(Immune-mediated drug hypersensitivity reaction, IDHR)。虽然按照要求在上市前对TCMIs进行了全身主动过敏、被动皮肤过敏等试验,但仍不能全面、准确地反映和预测临床上TCMIs不良反应的发生,这表明其安全性评价研究还存在问题,尤其是免疫毒理方而。因此,《TCMIs安全性再评价非临床研究技术原则》明确指出鼓励采用新技术、新方法,但需提供可行性依据,以作为评价的基础。胭窝淋巴结实验(popliteal lymph node assay,PLNA)是国外应用较为成熟的、目前为止被公认、唯一的用来预测小分子化合物(low molecular weight compands, LMWCs)的致敏性,筛选药物免疫毒理能力的方法。它具有可靠、快速和可重复的优点。它主要针对药物致敏诱导阶段,以局部引流淋巴结细胞增殖为观察终点,研究药物的呈递与识别过程。以淋巴细胞活化、增殖、分化及细胞因子和特异性抗体的分泌为观察对象,判断药物的致敏潜能,从而评价其致敏性。本研究根据TCMIs主要成分为LWMCs的特点,应用并改进现有PLNA,运用流式细胞术检测有致敏潜能的药物在致敏阶段引起PLN免疫细胞比例及其多个表面分子的变化,从中筛选出三类二十余种较稳定及灵敏的指标,探讨综合运用它们评价TCMIs致敏潜能的可行性。主要结果如下：(一)研究方法的建立在现有PLNA的基础上,运用流式细胞术检测被免疫动物在3d、5d、7d PLN免疫细胞比例及其表面分子的变化,光学显微镜下观察PLN的病理变化,结果表明在第5天流式检测指标大都发生显著变化,第7天PLN的病理变化明显。综合分析后确定第5天为本研究的取材时间。本研究在确定取材时间后,分析已知具有致敏潜能的四个PLNA中常用阳性药引起的免疫细胞及表而分子的变化,并经多次实验,最终确定了T、B细胞比例及其早期活化分子CD69、MHC Ⅱ类分子,抗原提呈细胞比例(树突状细胞、巨噬细胞)及其协同刺激分子CD80、CD86、CD40、CD152,效应T细胞表面分子CD44共三类二十余种较为稳定和灵敏的检测指标。结果显示对三类指标的综合分析能反映药物致敏性的强弱,并对药物预警、致敏性评价提供重要的参考和依据,应用该实验方法判断物质的致敏潜能具有可行性。(二)29利,TCMIs致敏潜能的评价本研究运用筛选指标对临床常用的29种TCMIs进行了检测,结果表明：不同TCMIs引起的变化不同,痰热清、苦碟子、鸦胆子、艾迪、香丹等注射液引起三类表面分了发生显著变化；血塞通、茵栀黄、黄芪、柴胡、复方苦参、醒脑静等注射液引起两类表面分子发生变化,且变化强度不同;生脉、鱼腥草、正清风痛宁等注射液仅引起极个别表面分子变化。综合分析表面分子的变化判断其致敏性的结果与现有文献报道的过敏反应情况具有一定的一致性,表明本研究方法可以为TCMIs的致敏性评价提供重要的参考,可做为安全性评价的重要依据。(三)不同厂家、不同批号及不同剂型TCMIs致敏潜能的评价本研究检测了不同厂家、不同剂型的双黄连注射剂,同一厂家不同剂型不同批次的血塞通注射剂,不同批次的痰热清注射液、正清风痛宁注射液引起的表而分子的变化,结果显示其致敏潜能存在一定差异。(四)应用佐剂的可行性探讨本研究对动物实验中常用的弗氏完全佐剂(complete freund’s adjuvant,CFA)和明矾佐剂(Alum Adjuvant)能否应用于PLNA评价TCMIs的致敏性进行了探索。结果认为,CFA不适宜作为佐剂应用于PLNA中,而Alum是否可以应用,值得进一步探讨。本研究建立了运用流式细胞术对PLN免疫细胞表面分子变化进行综合分析、判断物质的致敏潜能的方法,并应用于TCMIs的致敏性分析；结果表明不同种类TCMIs引起免疫细胞表面分子变化不同,本研究结果可以为TCMIs过敏性评价提供重要依据；并且.发现不同厂家、不同批号及不同剂型的同种TCMIs引起的免疫细胞表面分子变化不同,其致敏性有差异。在TCMI致敏性评价中要考虑TCMI自身的复杂性和特殊性,有必要采取多种方法相结合的方式来综合评价,才能得出较为全而准确的评价结果。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-8
目录  8-10
引言  10-11
第一章研究背景及立题依据  11-18
  1.1 TCMIs的不良反应现状及类型  12
  1.2 TCMIs过敏反应发生的原因  12-13
    1.2.1 中药提取工艺不够完善  13
    1.2.2 中药给药途径不断变化  13
    1.2.3 临床配伍及个体差异  13
    1.2.4 其他原因  13
  1.3 免疫介导的药物超敏反应研究现状  13-14
  1.4 TCMIs致敏性的主要检测方法  14-15
    1.4.1 主动皮肤过敏试验(active cutaneou anaphylaxis,ACA)  14
    1.4.2 主动全身过敏试验(active systemic anaphylaxis,ASA)  14
    1.4.3 被动皮肤过敏试验(passive cutaneous anaphylaxis,PCA)  14-15
    1.4.4 回肠条或气管条收缩试验  15
    1.4.5 细胞因子和蛋白检测法  15
    1.4.6 体外肥大细胞释放组胺试验  15
    1.4.7 体外补体激活试验  15
  1.5 胭窝淋巴结实验(popliteal lymph node assay,PLNA)  15-18
第二章研究方法的建立  18-38
  2.1 材料和方法  18-22
    2.1.1 实验材料  18-20
    2.1.2 实验方法  20-22
  2.2 结果与分析  22-36
    2.2.1 确定最佳取材时间  22-28
    2.2.2 阳性药物对胭窝淋巴结免疫细胞表而分子表达的影响  28-32
    2.2.3 OVA对已筛选指标的影响  32-35
    2.2.4 不同溶媒溶解STZ影响免疫细胞表面分子表达的比较  35-36
  2.3 讨论  36-37
  2.4 小结  37-38
第三章 29种TCMIs致敏潜能的评价  38-53
  3.1 材料和方法  38-40
    3.1.1 实验材料  38-40
    3.1.2 实验方法  40
  3.2 结果与分析  40-51
  3.3 讨论与小结  51-53
第四章不同厂家、批号及剂型TCMIs致敏潜能的评价  53-63
  4.1 材料和方法  53
    4.1.1 实验材料  53
    4.1.2 实验方法  53
  4.2 结果与分析  53-61
  4.3 讨论  61-62
    4.3.1 不同厂家、不同剂型的双黄连注射剂影响表面分子表达的比较  61-62
    4.3.2 不同批号及剂型血塞通注射剂影响表面分子表达的比较  62
    4.3.3 不同批号痰热清注射液影响表面分子表达的比较  62
    4.3.4 不同批号风痛宁注射液影响表面分子表达的比较  62
  4.4 小结  62-63
第五章应用佐剂的可行性  63-66
  5.1 材料和方法  63
    5.1.1 实验材料  63
    5.1.2 实验方法  63
  5.2 结果与分析  63-65
  5.3 讨论  65
  5.4 小结  65-66
第六章结论与展望  66-67
  6.1 结论  66
    6.1.1 建立实验方法  66
    6.1.2 评价29种TCMIs的致敏潜能  66
    6.1.3 评价不同厂家、批号及和剂型TCMIs致敏潜能  66
    6.1.4 应用佐剂的可行性探讨  66
  6.2 展望  66-67
参考文献  67-71
附录  71-73
  附录1：英文缩写  71-72
  附录2：研究生在校期间发表论文情况  72-73
致谢  73

腘窝淋巴结试验在TCMIs过敏性评价中的应用研究

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