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5-HT1A受体调节焦虑行为的分子和细胞机制

作　者: 张晶
导　师: 朱东亚
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: 5-HT1A受体焦虑症海马 nNOS CREB突触发生神经发生
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 512次
引　用: 1次
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内容摘要

焦虑情绪被认为是机体对于可见或未知的危险刺激，产生的一种自然反应。然而，过度的焦虑，或者称为病理性的焦虑，却是有害和危险的。作为一种人类普遍存在的情绪反应，焦虑可以使人感觉疲劳、紧张、担心、注意力不集中、失眠、快感缺失以及缺乏安全感。在全球范围内，焦虑相关疾病已经成为影响人们生活质量的主要诱因。25%的成年人在他们一生中的某个阶段会遭遇焦虑相关疾病，全球每年用于治疗该类疾病的相关花费超过40亿美元。尽管如此，焦虑症的治疗手段依然有限。临床上广泛采用的抗焦虑药是5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)和苯二氮卓类药物，其中SSRIs类药物的主要作用靶点是5-羟色胺系统，苯二氮卓类药物的主要作用靶点是γ-氨基丁酸(GABA)能系统。5-羟色胺(5-HT)系统对于焦虑症的调节是非常敏感的。在众多的5-HT受体亚型中，5-HT1A受体(5-HT1AR)对焦虑行为的调节作用最受关注。有研究发现，5-HT1AR敲除之后，小鼠表现出焦虑样的行为学特征。在海马和纹状体组织特异性表达5-HT1AR可以挽救小鼠5-HT1AR敲除导致的焦虑样行为。然而，产生这一效应的机制，迄今未明。海马是与情感疾病相关的大脑边缘系统构成的组织之一。早期通过磁共振成像(MRI)技术发现在抑郁症病人中出现了海马体积的减少，并且推测这种改变是由于神经元再生减少所导致的。近来，通过各种手段抑制海马神经元再生确实导致了抑郁和焦虑症状的出现，同时抗抑郁药的行为学作用依赖于其对神经元再生的调节。5-HT1AR在神经元再生中的作用是肯定的，其对SSRIs诱发的神经元再生是必需的，5-HT1AR激动剂刺激海马神经元再生，而拮抗剂抑制海马神经元再生。然而，抗焦虑药的作用机制是多方面的，包括药物直接作用于HPA轴，在神经元再生被抑制之后，该药物依然有效，从这点说明除了神经元再生以外还有其他独立机制的存在，这些机制可能包括海马结构可塑性的改变。这种假说已有研究证明，在抑郁症动物模型中海马树突棘的数量是减少的。nNOS产生的NO是一种位于中枢神经系统具有信号传导作用的气体小分子，它可能是5-HT1AR调节焦虑相关行为的一个重要的下游信号分子。近年有研究发现nNOS抑制剂在病理条件下具有抗抑郁样作用。同时我们实验室最近的研究也表明nNOS产生的NO可以通过抑制海马神经元再生参与调节慢性应激引起的抑郁症。这些研究结果都表明NO参与了抑郁症的发病与治疗过程。环磷腺苷反应原件结合蛋白(CREB)主要参与活性相关的基因转录的调节，可以参与多种神经元的功能，包括突触的可塑性和记忆。其中，CREB磷酸化对于海马区的神经发生起着非常重要的作用。近来，有研究发现，CREB也可以参与情绪相关行为的调控，比如说焦虑症。CREB敲除的小鼠，在高架十字迷宫、明暗箱和旷场等行为学检测中，表现为焦虑相关的行为增加。但是，CREB参与调节焦虑相关行为的机制并不明确。综上所述，5-HT1AR可能通过nNOS-CREB通路，进而通过调节海马结构可塑性影响焦虑行为。基于上述的假说，本课题的研究内容分为三个部分，分别研究nNOS-CREB通路在5-HT1AR调节焦虑相关行为中的作用， CREB介导的海马结构可塑性在5-HT1AR调控焦虑相关行为中的作用，以及CREB活性在5-HT1AR介导的神经环路建立中的意义。在第一部分研究中，我们首先通过离体和在体的手段，分别检测了5-HT1AR选择性激动剂与拮抗剂，SSRIs对nNOS表达的调节作用。得到的结果是5-HT1AR激动剂和SSRIs均可以下调海马区nNOS的表达，5-HT1AR拮抗剂可以上调海马区nNOS的表达。其它类型单胺系统的抗焦虑药对海马区nNOS的表达没有影响。同时，我们检测了nNOS在5-HT1AR调节焦虑中的作用。得到的结果是5-HT1AR激动剂和SSRIs的抗焦虑作用和5-HT1AR拮抗剂的致焦虑作用在nNOS敲除小鼠上消失了。我们还使用了立体定位的方法，在海马区给予选择性nNOS抑制剂7-NI可以营救海马区给予5-HT1AR选择性拮抗剂产生的致焦虑作用。为了进一步研究nNOS调节焦虑相关行为的下游信号分子，我们检测了5-HT1AR激动剂与拮抗剂对CREB活性的调节作用。结果发现5-HT1AR选择性激动剂8-OH-DPAT可以升高磷酸化cAMP反应原件结合蛋白(pCREB)的水平，5-HT1AR选择性拮抗剂NAN-190可以降低pCREB的水平，但是这个效应在nNOS敲除的小鼠中消失。通过海马区给予PKA抑制剂H89，抑制海马区的CREB磷酸化，可以阻断7-NI的抗焦虑样作用。因此，第一部分的研究结果说明：海马区的nNOS和CREB活性介导了5-HT1AR激动剂和SSRIs的抗焦虑作用。在第一部分中，我们发现海马区的CREB活性介导了5-HT1AR激动剂和SSRIs的抗焦虑作用。在第二部分，我们主要研究5-HT1AR上调海马区CREB活性所产生的进一步效应，主要观察其对海马结构可塑性的调节作用。在该部分，我们使用PKA拮抗剂H89和慢病毒包装CREB Ser133位点负显性突变体(CREB133)来下调CREB活性，同时，我们使用PKA的激动剂Forskolin和慢病毒包装CREB过表达片段(VP16-CREB)来上调CREB活性，从而研究CREB介导的海马结构可塑性在5-HT1AR调制焦虑行为中的作用。结果发现，无论是在体水平还是离体水平，8-OH-DPAT均可以上调海马区突触发生相关蛋白突触素(Synapsin)和棘蛋白(Spinophilin)的表达，并且这种作用可以被H89和CREB133所中和掉。同时，NAN-190可以下调海马区突触素和棘蛋白的表达，这种作用也可以被Forskolin和VP16-CREB所挽救。使用BrdU标记新生的神经元，8-OH-DPAT可以上调调海马区的神经发生，并且这种作用可以被H89和CREB133所中和掉。同时，NAN-190可以下调海马区的神经发生这种作用也可以被Forskolin和VP16-CREB所挽救。通过新奇摄食抑制模型、旷场模型和高架十字迷宫模型等反映焦虑相关行为的动物行为学检测手段，我们发现海马区立体定位给予H89和CREB133可以中和掉8-OH-DPAT的抗焦虑作用，海马区立体定位给予Forskolin和VP16-CREB可以营救NAN-190的致焦虑作用。因此，第二部分的研究结果说明：海马区CREB活性介导的海马结构可塑性诠释了5-HT1AR对焦虑行为的调控作用。在第三部分，我们使用转染了绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的原代神经元与分化状态的神经干细胞共培养，模拟在体状态下新生神经元与原有神经元之间神经环路的建立，从而研究5-HT1AR参与调节新生神经元与原有神经元之间神经环路的建立，以及CREB活性在这个过程中所发挥的作用。在该部分，我们发现8-OH-DPAT可以上调新生神经元与原有神经元之间的突触联系，并且这种作用可以被H89和CREB13中和掉。同时， NAN-190可以下调新生神经元与原有神经元之间的突触联系，这种作用可以被Forskolin和VP16-CREB所挽救。因此，第三部分的研究结果说明： CREB活性可能参与了5-HT1AR调节新生神经元与原有神经元之间神经环路建立的过程。

全文目录

英文缩略词表  4-7
中文摘要  7-11
Abstract  11-16
前言  16-34
  参考文献  26-34
第一章：海马 nNOS 是 5-HT1AR 调制焦虑行为的效应分子  34-69
  摘要  34-35
  前言  35-36
  材料和方法  36-42
  实验结果  42-62
  讨论  62-65
  结论  65
  参考文献  65-69
第二章：CREB 介导的海马结构可塑性诠释了 5-HT1AR 对焦虑行为的调控作用  69-111
  摘要  69-70
  前言  70-71
  材料和方法  71-75
  结果  75-103
  讨论  103-105
  结论  105-106
  参考文献  106-111
第三章：5-HT1AR 通过调节 CREB 活性介导神经环路的建立  111-130
  摘要  111
  前言  111-112
  材料和方法  112-115
  结果  115-125
  讨论  125-126
  结论  126
  参考文献  126-130
全文总结  130-131
综述  131-151
  Reference  141-151
攻读学位期间发表论文情况  151-152
致谢  152-153

5-HT1A受体调节焦虑行为的分子和细胞机制

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