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内源性TNF-α在细菌脂蛋白诱导心肌细胞凋亡中的作用以及IL-10的保护效应

作　者: 黎志财
导　师: 周苏明
学　校: 南京医科大学
专　业: 老年医学
关键词: 乳鼠心肌 细菌脂蛋白 肿瘤坏死因子-α 白细胞介素-10 凋亡
分类号: R459.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


背景和目的：脓毒症（sepsis）是由感染引起的全身炎症反应综合征（systemicinflammatory response syndrome, SIRS），是创伤、烧伤、休克、感染等临床急危重患者严重的并发症之一，也是脓毒症休克（septic shock）和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）的重要原因。大约有50%的脓毒症患者可发生心功能障碍，其具体机制目前尚不十分清楚，心肌细胞凋亡可能在脓毒症所致心肌功能障碍中起到重要作用。脓毒症时过度释放的炎症因子，如肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）对心肌功能的损害已有大量的相关文献报道，是否病原微生物本身对心肌细胞也有直接或间接的作用，却少有这方面的研究。另外，我们课题组前期研究发现：细菌脂蛋白（Bacterial lipoprotein，BLP）耐受后的脓毒症小鼠其心功能明显得到改善，并观察到耐受组小鼠在脓毒症早期其心脏内白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）表达水平较假手术组以及脓毒症模型组均表达增高，这提示我们IL-10可能参与了脓毒症时心功能的改善。此外，在一些心脏疾病，如缺血再灌注损伤、心肌梗死和心力衰竭中，亦发现到IL-10具有保护心功能的作用，然而IL-10对脓毒症所致心功能障碍的影响如何尚未有相关报道。本研究通过体外培养大鼠乳鼠心肌细胞，探讨BLP刺激心肌细胞所产生的TNF-α对心肌凋亡的影响，以及观察IL-10拮抗BLP诱导心肌凋亡的效应。方法：1.体外培养乳大鼠心肌细胞，用BLP和TNF-α刺激心肌细胞，采用Hoechst33342染色观察心肌细胞核固缩现象；Annexin V-FITC/PI双染观察心肌细胞膜结构及通透性改变。2.加入同一浓度（1μg/ml）的BLP分别刺激心肌细胞0、12、24、36、48h，以及将不同浓度（0、0.25、0.5、1、2、5μg/ml）的BLP分别刺激心肌细胞24h；另实验采用同一浓度(20ng/ml)的TNF-α分别刺激心肌细胞0、12、24、36、48h，以及将不同浓度（0、5、10、20、40、60ng/ml）的TNF-α分别作用心肌细胞24h。提取细胞蛋白，采用Western blot技术检测心肌细胞procaspase-3及cleaved caspase-3的表达水平。3.同一浓度（5μg/ml）BLP分别刺激心肌细胞4、8、12、24、36、48h，以及将不同浓度（0、0.5、1、2、5、10μg/ml）的BLP分别刺激细胞12h，收集细胞上清，采用ELISA法测定上清中TNF-α的浓度。4.将心肌细胞分为以下八组：空白对照组、WP9QY（10μM）组、BLP（5μg/ml）组、WP9QY（10μM）+BLP（5μg/ml）组、WP9QY（20μM）+BLP（5μg/ml）组、TNF-α（20ng/ml）组、WP9QY（10μM）+TNF-α（20ng/ml）组、WP9QY（20μM）+TNF-α（20ng/ml）组，提取细胞蛋白，采用Westernblot法检测各组bax、bcl-2、procaspase-3及cleaved caspase-3的表达。5.将细胞分为以下五组：空白对照组、BLP（5μg/ml）组、IL-10（20ng/ml）组、IL-10（20ng/ml）+BLP（5μg/ml）组、BLP（5μg/ml）+IL-10（20ng/ml）组，提取细胞蛋白，采用Western Blot法检测各组心肌细胞bax、bcl-2、procaspase-3及cleaved caspase-3的表达。6.将心肌细胞分为以下八组：空白对照组、WP9QY（20μM）组、BLP（5μg/ml）组、WP9QY（20μM）+BLP（5μg/ml）组、TNF-α（20ng/ml）组、WP9QY（20μM）+TNF-α（20ng/ml）组、IL-10(20ng/ml)组、IL-10(20ng/ml)+BLP（5μg/ml）组。收集心肌细胞，Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果：1. BLP和TNF-α均能够促使心肌细胞核固缩以及细胞膜结构改变和通透性增加。2. BLP和TNF-α均可呈时间和浓度依赖性促进心肌细胞caspase-3的活化。3.心肌细胞在BLP刺激下可分泌TNF-α，于12小时达到高峰。不同浓度的BLP刺激心肌细胞后可浓度依赖性促使TNF-α表达升高。4.心肌细胞预处理TNF-α拮抗剂WP9QY后，可使BLP刺激心肌细胞后caspase-3活化减少以及bax/bcl-2表达比率降低。5. IL-10预处理或是后处理心肌细胞，均能够使BLP刺激心肌细胞后caspase-3活化减少以及bax/bcl-2表达比率降低。6.流式细胞术分析证明：WP9QY和IL-10两者均能够降低BLP诱导心肌细胞凋亡的比率。结论：1. BLP刺激心肌细胞产生的内源性TNF-α在BLP诱导心肌细胞凋亡中起到一定的作用。2. IL-10具有拮抗BLP诱导的心肌细胞凋亡的效应。

全文目录


缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-16
材料与方法  16-26
  一、实验材料  16-19
  二、实验方法  19-26
结果  26-37
  1. 乳鼠心肌细胞培养  26-27
  2. BLP 和 TNF-α对心肌细胞凋亡的影响  27-29
  3. BLP 和 TNF-α 时间和浓度依赖性促进心肌细胞 caspase-3 激活，并增高bax/bcl-2 蛋白表达比率  29-31
  4. 心肌细胞在 BLP 刺激下表达 TNF-α  31-32
  5. 内源性 TNF-α在 BLP 诱导心肌细胞凋亡中起到一定作用  32-34
  6. IL-10 拮抗 BLP 诱导的心肌细胞凋亡  34-37
讨论  37-44
  1. BLP 和 TNF-α对心肌细胞凋亡的影响  37-40
  2. BLP 刺激心肌细胞产生 TNF-α  40-41
  3. 内源性TNF-α在细菌脂蛋白诱导心肌细胞凋亡中的作用  41-42
  4. IL-10对心肌凋亡的抑制作用  42-44
结论  44-45
参考文献  45-50
综述  50-62
  参考文献  57-62
攻读学位期间发表文章情况  62-63
致谢  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 治疗学 > 急症、急救处理
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