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两种不同矿化诱导液对根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化的影响

作　者: 王玲菲
导　师: 廖红兵
学　校: 广西医科大学
专　业: 口腔修复学
关键词: 根尖乳头干细胞 KH2PO4 矿化诱导液
分类号: R780.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的干细胞需要经历增殖、诱导分化的阶段,才能获得需要的生物表性,干细胞向成骨/成牙本质细胞谱系分化的前提是经过矿化诱导阶段。目前用于干细胞矿化诱导的矿化液种类较多,配方各异,各成分在某些配方中的添加浓度也有不同,最终的矿化诱导效果有差异。近来有文献把KH2PO4作为矿化液的常规添加成分,与矿化诱导液其他成分共同起矿化诱导作用。与矿化诱导液其他的成分相比,KH2PO4的作用机制有待进一步阐明,它对各类干细胞是否具有广泛促矿化作用,也尚未见报道。根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla, SCAP)来源于根尖未发育完全的根尖乳头组织,是间充质干细胞的一种,被认为是牙再生组织工程重要的细胞来源,SCAP在矿化液诱导下可以向成骨/成牙本质细胞谱系分化。本研究选用SCAP作为含KH2PO4矿化液的矿化作用靶细胞,通过体外/体内实验,观察含KH2PO4矿化液对SCAP细胞增殖能力和成骨/成牙本质向分化能力的影响,试阐明KH2PO4在矿化液中的作用机理,以及与其他矿化诱导液诱导效能相比,矿化液中添加KH2PO4的优越性。方法从根尖孔未发育完全、带有根尖乳头软组织的年轻恒牙,分离并提纯SCAP细胞,评价体内/体外SCAP细胞在两种不同矿化诱导液中的增殖和分化能力。一、配置两种矿化诱导液,分别为含(MM2)/不含(MM1)KH2PO4(1.8mM)的两种矿化诱导液(50μg/mL抗坏血酸、10nM地塞米松、lOmM β-甘油磷酸),L-DMEM培养液为对照组(Control组),分别用于培养SCAP细胞。二、体外实验,通过四唑盐比色实验(MTT)、流式细胞术(FCM)检测细胞周期,绘制生长曲线图和计算生长指数,评价SCAP细胞经过两种不同矿化液诱导后体外增殖能力：通过碱性磷酸酶(ALP)检测和茜素红钙结节染色,以及Western blot和Real-time RT-PCR分别从蛋白和基因水平检测相关矿化指标(DSP/DSPP, OCN/OCN),评价SCAP细胞经过两种不同矿化液诱导后体外分化能力。三、体内实验,从4-7d SD大鼠磨牙分离出SCAP细胞,经过两种不同矿化液诱导后,制成细胞团放入预先处理的大鼠切牙根片段,一同植入8-10w的雌性大鼠肾被膜下。14d后,移植组织块回收,样本于4%福尔马林固定,脱钙,进行石蜡包埋,切片后分别做HE染色和免疫组织化学染色,检测成骨/成牙本质向分化相关蛋白(OCN,DSP)表达强度,比较SCAP细胞经过两种不同矿化液诱导后体内分化能力：结果一、体外实验：四唑盐比色实验和流式细胞术显示两矿化诱导液组SCAP细胞的增殖能力都增高,其中MM2组的SCAP细胞增殖能力高于MM1组。两矿化诱导液组的碱性磷酸酶活性均高于对照组,其中MM2组的碱性磷酸酶活性明显提高(P<0.01)。MM2组与其余两组相比,表现出更多的钙结节沉积。Western Blot及Real-time RT-PCR结果显示：MM2组的SCAP细胞早期成骨/成牙本质向分化相关指标表达明显高于MM1组的SCAP细胞的表达(如：DSP/DSPP、OCN/OCN; P<0.05),进一步从蛋白和基因水平证实,加KH2PO4的矿化诱导液能促进SCAP细胞的早期成骨/成牙本质向分化能力。二、体内实验,肾被膜下移植的含SCAP细胞团牙根片段两周后回收,HE染色显示：各组牙根片段内都有牙髓样组织形成,对照组没有新的矿化组织形成,两矿化诱导液组在根管内都有新的矿化组织形成,而MM2组的SCAP细胞团形成更多的矿化组织：免疫组织化学检测样本DSP和OCN的表达,MM1组OCN表达呈弱阳性,DSP表达呈阳性；MM2组OCN表达呈阳性,DSP表达呈强阳性,MM2组目的蛋白的表达明显比MM1组表达强。与其余两组相比较,MM2组SCAP细胞团表达更多的成骨/成牙本质向分化相关蛋白。结果显示,含KH2PO4的矿化诱导液培养的SCAP细胞增殖能力增强,成骨/成牙本质向分化相关蛋白的表达水平上调。结论本研究表明,加KH2PO4的矿化诱导液能增强SCAP细胞的早期成骨/成牙本质向分化能力：与其他矿化诱导液相比,含KH2PO4的矿化诱导液矿化效能更高；KH2PO4可能是一种方便,经济的干细胞矿化诱导剂成分。

全文目录


英文缩略语表  5-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-16
实验一  16-29
  1、材料与方法  18-24
  2、结果  24-25
  3、附图  25-27
  4、讨论  27-28
  5、结论  28-29
实验二  29-49
  1、材料与方法  31-39
  2、结果  39-41
  3、附图  41-47
  4、讨论  47-48
  5、结论  48-49
实验三  49-62
  1、材料与方法  50-55
  2、结果  55-56
  3、附图  56-59
  4、讨论  59-61
  5、结论  61-62
全文小结  62-63
参考文献  63-67
致谢  67-68

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中图分类: > 医药、卫生 > 口腔科学 > 口腔病理学
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