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美满霉素在大鼠视神经损伤再生中的作用研究及对AIF、GFAP表达的影响

作　者: 王赟
导　师: 赵平
学　校: 河北医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 视神经损伤视神经节细胞美满霉素凋亡诱导因子胶质纤维酸性蛋白
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的:视神经损伤是以视功能进行性下降为临床特征的常见致盲性眼病，严重降低患者的生活质量，目前尚缺乏有效的治疗药物。视神经是由神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）的轴突构成，而视神经节细胞的死亡是各种视神经损伤类疾病如青光眼、外伤性视神经病变、颅内占位疾病等视功能下降的共同根源，且研究表明视神经损伤后RGCs死亡的重要方式是凋亡。故选择能够有效抑制视神经损伤后RGCs凋亡并促进其再生修复的药物是至关重要的。美满霉素（minocycline, MC）可通过抗凋亡、抗神经胶质细胞过度激活、抗神经炎症等多种途径发挥神经保护作用,是一种有效的神经细胞保护剂。然而美满霉素针对视神经损伤后的抗凋亡、抗胶质细胞过度激活、促神经修复等作用及机制目前尚未明确。凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)是主要的凋亡效应蛋白。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）是神经胶质细胞的标志蛋白，可反应神经胶质细胞的激活状态。本研究制造了大鼠视神经钳夹伤模型，实验组通过给予腹腔注射美满霉素与观察组进行对比，取材后在光镜下观察视网膜组织的形态学改变，并利用计算机图像分析技术对经免疫组织化学染色的视网膜组织中AIF、GFAP的平均光密度值(The average optical density value, AOD)进行半定量检测，以观察二者在视网膜组织中的表达情况。从而探讨美满霉素对损伤后视神经的再生修复作用及对视网膜组织中AIF、GFAP表达的影响，为其用于治疗视神经损伤提供理论依据。方法:健康SD大鼠80只（80只右眼）雌雄不限，体重200±20g，随机分四组：正常组、假损伤组（仅暴露右眼视神经）、实验组（行右眼视神经钳夹伤＋伤后即刻腹腔注射45mg/kg美满霉素液，此后一次每日至观察时间点）和对照组（行右眼视神经钳夹伤＋伤后即刻腹腔注射等量生理盐水，此后一次每日至观察时间点），每组20只大鼠（20只右眼）。分别按伤后1、3、7、14天四个时间点随机取各组大鼠5只，进行心脏灌注固定，摘除右侧眼球并剔除多余组织，后将视网膜组织固定切片。光学显微镜下观察经HE染色后视网膜组织的形态学变化，观察经免疫组织化学染色后视网膜组织中AIF、GFAP的表达变化。利用计算机图像分析技术对经免疫组织化学染色后视网膜组织中AIF、GFAP的平均光密度值(AOD)进行半定量检测。以免疫阳性染色的AOD来表示抗原表达量，AOD越高则阳性表达越强。应用SPSS13.0统计软件包分析资料，结果以均数±标准差来表示(x s)。同一时间点数据采用多样本均数的单因素方差分析（One-way，ANOVA），组间数据采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1各组大鼠视网膜HE染色结果正常组及假损伤组：视网膜组织结构清晰各时间点无明显变化，视网膜神经节细胞呈条带状排列无水肿及坏死。对照组：随着损伤时间延长大鼠视网膜组织结构明显水肿，可见空泡样变性，视网膜神经节细胞排列混乱、细胞核明显丢失稀疏。实验组：损伤早期视网膜组织结构较清晰，随损伤时间的延长可见视网膜神经节细胞水肿，但各时间点大鼠视网膜组织损伤程度均较对照组减轻，视网膜神经节细胞排列尚整齐，细胞核丢失程度较对照组轻。2AIF、GFAP的免疫组织化学染色及半定量检测结果2.1AIF相关结果AIF的免疫强阳性染色呈棕褐色表达于细胞浆，部分可表达于胞核内。正常组及假损伤组可见呈弱阳性的浅黄染色，各时间点无明显不同；对照组1d为弱阳性染色呈黄色，3d、7d呈持续性增强，7d达棕褐色，损伤14d染色明显减弱接近1d时呈黄色；实验组1d、3d、7d、14d均较对照组相应时间点免疫染色弱。免疫组化的半定量检测结果：正常组与假损伤组半定量检测的平均光密度值（AOD）在各时间点上差别均无统计学意义（P＞0.05），正常组1d时AOD为0.165±0.047；对照组1d、3d、7d、14d AOD分别为0.193±0.046、0.328±0.034、0.517±0.065、0.264±0.039与正常组各时间点相比差别均有统计学意义（P＜0.05），且对照组均高于正常组；实验组1d、3d、7d、14d AOD分别为0.184±0.018、0.239±0.024、0.287±0.028、0.189±0.009与正常组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，且实验组均高于正常组；对照组与实验组相比各时间点差异均有统计学意义(P＜0.05)，且实验组各时间点AOD均小于对照组。2.2GFAP相关结果GFAP的免疫强阳性表达成棕色，可位于视网膜内界膜于外界膜之间各层。正常组及假损伤组可见呈弱阳性的浅黄染色，各时间点表达无明显变化；对照组1d为弱阳性呈浅黄染色，3d染色加深，7d达呈高峰呈棕色，14d表达呈浅黄染色；实验组除14d外表达均较对照组弱，实验组14d时仍可达实验组3d时表达水平强于对照组3d的表达，但3d、7d、14d仍明显强于正常组。免疫组化的半定量检测结果：正常组与假损伤组半定量检测平均光密度值（AOD）在各时间点上差别无统计学意义（P＞0.05），正常组1d的AOD为0.178±0.085；对照组3d、7d AOD分别为0.328±0.034、0.484±0.025与正常组3d、7d AOD分别为0.168±0.013、0.182±0.085相比差异均有统计学意义（P＜0.05），两时间点AOD对照组均大于正常组；实验组3d、7d、14d的AOD分别为0.272±0.034、0.342±0.046、0.259±0.039与对照组3d、7d、14d的AOD分别为0.328±0.034、0.484±0.025、0.194±0.025相比差异均有统计学意义（P＜0.05），实验组AOD3d、7d时低于对照组、14d时高于对照组；3d、7d、14d实验组的AOD与正常组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），且实验组均高于正常组。结论:1应用美满霉素后视网膜组织的损伤程度较对照组明显减轻，说明美满霉素对受损的视神经具有保护作用。2应用美满霉素后视网膜组织中各时间点AIF表达水平均较对照组降低，证明美满霉素能够抑制视神经损伤后视网膜组织中AIF的表达。3应用美满霉素后视神经损伤早期视网膜中GFAP的表达水平较对照组减低，而损伤后期较对照组表达增加，证明美满霉素可抑制视神经损伤后视网膜组织中GFAP的过度表达，并延长GFAP的有益表达。

美满霉素在大鼠视神经损伤再生中的作用研究及对AIF、GFAP表达的影响

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