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HPLC法测定兔角膜基质中核黄素含量的实验研究

作　者: 伍腾飞
导　师: 彭秀军
学　校: 安徽医科大学
专　业: 眼科学
关键词: HPLC 核黄素角膜胶原交联回收率高效液相色谱分析法角膜胶原交联
分类号: R772.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的建立兔角膜基质中核黄素含量测定的高效液相色谱（high performance liquidchromatograph，HPLC）分析方法，并分析该方法的专属性、灵敏度和准确性。方法兔角膜组织匀浆经加热孵育和10%三氯乙酸去蛋白后离心，组织上清液经C18-SPE柱固相萃取后检测。高效液相色谱条件：色谱柱柱选择SinaChrom ODS-BP色谱柱（5μm，250mm×4.6mm ID）；以甲醇-纯水（体积比为40:60）为流动相，pH=7.0；流速：0.1mL/min；荧光检测器激发波长425nm，发射波长525nm。结果核黄素在1.0×10-6～1.0×10-4mg/mL范围与峰面积呈现良好的线性关系（r2=0.999584），最低检测限达到2×10-8mg/mL，精密度结果显示：相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）=0.86%（n=10）；方法稳定性检测得到样品溶液在24h内稳定性RSD=0.51%；测得的角膜样品核黄素加标平均回收率为99.3%，RSD为3.7%。结论本实验研究中建立的样品前处理方法简单，且HPLC方法专属性强、灵敏度高、准确性好，可作为紫外线A/核黄素胶原交联的学位论文">角膜胶原交联法中角膜基质内核黄素含量测定的定量方法。目的用高效液相色谱（HPLC）分析法检测不同条件下角膜基质中核黄素的含量，分析比较去上皮、不去上皮以及使用促渗剂乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA）对核黄素在角膜基质渗透的影响，初步探讨EDTA在跨角膜上皮胶原交联中的可行性依据。方法新西兰白兔15只，随机分为去上皮组、EDTA组和不去上皮组3组，每组5只，处理：去上皮组去除角膜完整上皮，EDTA组不去上皮点0.5%EDTA1h，不去上皮组不做处理，之后各组兔眼分别滴0.1%核黄素+20%右旋糖酐30分钟，随后去除EDTA、不去上皮组角膜完整上皮，钻取各分组兔眼直径8.5mm角膜中央组织，制取角膜组织匀浆上清液，在建立好的高效液相色谱分析法条件下对各组组织匀浆上清液进行核黄素定量检测。结果0.1%核黄素+20%右旋糖酐点眼30分钟后去上皮组角膜基质中核黄素含量为23.54±1.61μg/g组织，EDTA组为2.04±0.25μg/g组织，不去上皮组为1.44±0.06μg/g组织。去上皮组、EDTA组、不去上皮组角膜样品中核黄素含量的总体差异有统计学意义（F=1792.839，P=0.000）。去上皮组和EDTA组角膜样品中核黄素含量较不去上皮组明显增多，差异均有统计学意义（t=43.408、t=7.484，p<0.05），去上皮组与EDTA组比较，差异亦有统计学意义（t=41.780，p<0.05）。除去上皮组角膜基质内核黄素含量超过15μg/g组织以外，其余两组均未达到此理论值。结论交联术前的去角膜上皮能充分提高核黄素在角膜基质内的弥散有利于经典胶原交联法的顺利开展。促渗剂EDTA虽能有效促进核黄素在角膜的渗透，可为研究EDTA条件下的跨角膜上皮胶原交联提供实验依据，但尚不能取代去角膜上皮对核黄素在角膜渗透的作用，提高其促渗效果的条件还有待进一步研究。

全文目录

英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
第一部分兔角膜基质中核黄素含量测定的 HPLC 方法建立  12-27
  1 前言  12-15
  2 材料和方法  15-19
    2.1 材料  15
    2.2 方法  15-19
    2.3 统计学处理  19
  3 结果  19-23
    3.1 专属性  19-21
    3.2 线性关系及灵敏度  21-22
    3.3 精密度  22
    3.4 稳定性  22
    3.5 加标回收率  22-23
    3.6 角膜样品检测结果  23
  4 讨论  23-24
  5 结论  24-25
  参考文献  25-27
第二部分三种条件下兔角膜基质中核黄素含量测定  27-49
  1 前言  27-34
  2 材料与方法  34-35
    2.1 材料  34
    2.2 方法  34-35
    2.3 统计学处理  35
  3 结果  35-41
    3.1 各组角膜组织的变化及检测色谱曲线  35-40
    3.2 各组角膜组织中核黄素的含量  40-41
  4 讨论  41-44
  5 结论  44
  参考文献  44-49
附录  49-51
致谢  51-52
综述  52-62
  参考文献  59-62

HPLC法测定兔角膜基质中核黄素含量的实验研究

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