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PI3K/Akt信号通路对上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药与上皮间质转化关系的影响

作　者: 李少星
导　师: 徐春琳
学　校: 河北医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 上皮性卵巢癌 顺铂耐药 上皮间质转化 PI3K/Akt信号转导通路
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的:卵巢癌是女性生殖器官恶性肿瘤之一，其中最常见的是上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer,EOC），由于其发病隐匿，缺乏早期诊断方法，多数患者确诊时已属晚期，并发生腹腔及远处转移，死亡率居妇科恶性肿瘤首位，严重威胁女性的健康和生命。目前，彻底的肿瘤细胞减灭术和以铂类药物为基础的联合化疗是卵巢癌的主要治疗方法。但是，由于肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，严重影响了治疗效果，导致5年生存率仍然徘徊在30%-40%。因此，探索上皮性卵巢癌化疗耐药的分子机制及克服策略，对改善化疗药物的临床疗效，降低卵巢癌患者的死亡率具有重要意义。近年来研究显示，上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)与肿瘤化疗耐药密切相关。EMT是指在特定的生理和病理情况下，上皮表型细胞转化为间质表型细胞的过程，同时，细胞骨架发生重塑，侵袭迁移能力增加，抗凋亡能力增强，上皮及间质细胞标志物表达改变。肿瘤耐药是肿瘤化疗失败和复发的关键因素。铂类作为上皮性卵巢癌治疗的一线化疗药物，由于持续化疗产生的获得性耐药常致治疗失败。越来越多的证据表明，EMT不仅在肿瘤的进展和转移中发挥重要作用，而且参与肿瘤的耐药与复发，避免细胞外信号对肿瘤细胞的作用，促使其逃逸凋亡机制。磷脂酰肌醇-3-激酶／丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B(phosphoinositol-3-kinase/serine-threonine protein kinase B，PI3K/Akt)信号途径是细胞内重要的信号转导通路,在肿瘤的进展、转移、化疗耐药等活动中发挥重要的生物学功能。但是，目前对上皮性卵巢癌化疗耐药与EMT的相关性研究仍然有限，因此探讨卵巢癌化疗耐药与EMT的内在联系及信号转导途径，对深入理解卵巢癌的耐药机制，寻找新的干预靶点具有重要意义。本研究通过体外培养上皮性卵巢癌细胞株和卵巢癌顺铂耐药细胞株，观察两种细胞的形态、迁移能力、EMT分子标志物及PI3K/Akt信号通路效应分子表达水平的差异，旨在探讨上皮性卵巢癌耐药细胞是否发生EMT及其分子机制，同时进一步研究PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002能否逆转卵巢癌耐药细胞的EMT表型，增强其对顺铂的敏感性，拟为上皮性卵巢癌的化疗耐药机制和治疗策略提供新思路。方法：将人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV-3、人卵巢浆液性囊腺癌顺铂耐药细胞株SKOV-3/DDP置于37℃，饱和湿度5%CO2，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中常规培养。1MTT法：消化对数生长期的SKOV-3和SKOV-3/DDP两种细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/ml,每孔100ul接种于96孔培养板中。待细胞贴壁后，以不同浓度的DDP（0、0.625、1.25、2.5、5、10ug/ml）作用于两种细胞24、48h，以0ug/ml DDP作为对照组。用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测DDP对两种细胞的生长抑制作用，测定耐药细胞的耐药指数。2光镜观察：选取对数生长期及DDP处理的SKOV-3和SKOV-3/DDP两种细胞，在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化。3细胞划痕实验：取对数生长期的SKOV-3和SKOV-3/DDP细胞，消化后分别接种于两个6孔板中，待培养至80％-90％融合，并形成一单层覆盖各孔时，于各孔中央划一垂直直线，PBS液洗涤，去除漂浮细胞，加入低浓度血清培养基，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。于划痕后0和24小时观察，每孔至少记录6张图片，同时进行24小时内的细胞计数。应用Photoshop程序软件测量划痕未愈合区的面积，计算划痕愈合面积的比例及细胞增殖率。4蛋白印迹法：检测对数生长期的SKOV-3和SKOV-3/DDP两种细胞及SKOV-3/DDP细胞各实验组中E-cadherin、Vimentin和p-Ak（tThr308）蛋白的表达情况。SKOV-3/DDP细胞实验分组如下：①Ctrol组：仅以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养细胞24h；②DDP组：2.5ug/ml的DDP作用于SKOV-3/DDP细胞24h；③LY294002组：10umol/LLY294002作用于SKOV-3/DDP细胞24h；④LY294002+DDP组：LY294002作用SKOV-3/DDP细胞30min后，再加入2.5ug/ml的DDP作用细胞24h。5流式细胞术：采用碘化丙啶(propidium iodide, PI)标记的流式细胞术检测LY294002能否增强SKOV-3/DDP细胞对顺铂的敏感性。实验分组同蛋白印迹法。6应用SPSS13.0统计软件进行数据分析。结果：1MTT结果:不同浓度的顺铂作用于SKOV-3和SKOV-3/DDP细胞后，随着浓度增加和时间延长，两种细胞的抑制率较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。相同浓度的顺铂作用于SKOV-3和SKOV-3/DDP细胞，随时间延长，前者抑制率明显高于后者，差异有统计学意义(P<0.05)。提示SKOV-3细胞对顺铂的敏感性高于SKOV-3/DDP耐药细胞。2细胞形态观察结果:SKOV-3细胞多为椭圆形，鹅卵石样，细胞连接紧密，聚集成片状生长，呈上皮细胞形态；耐药性SKOV-3/DDP细胞呈梭形，极性丢失，排列紊乱，细胞分散，伸出伪足形成伸长的纺锤细胞形态，表现为间质细胞形态。2.5ug/ml DDP作用于SKOV-3细胞24h后，细胞形态变化明显，大部分变为圆形，细胞凋亡，细胞膜皱缩，体积普遍变小，贴壁能力减弱。20ug/ml DDP作用于SKOV-3/DDP细胞24h后，圆形细胞开始逐渐增多，部分细胞出现凋亡，细胞膜开始皱缩，体积变小。3细胞划痕实验结果：划痕后细胞继续培养24h，显微镜下观察，SKOV-3/DDP细胞划痕愈合面积（45.90%）较SKOV-3细胞（13.93%）增加(P<0.05）,而细胞增殖率无明显升高(P>0.05)。提示耐药性SKOV-3/DDP细胞的迁移能力较SKOV-3细胞增强。4蛋白印迹结果:（1）基础状态下，SKOV-3/DDP与SKOV-3细胞E-cadherin的表达水平分别为（0.005±0.002）、（0.764±0.017），Vimentin的表达水平分别为（0.687±0.013）、（0.007±0.001），p-Akt(Thr308)的表达水平分别为（0.749±0.021）、（0.375±0.014）；结果显示，SKOV-3/DDP细胞E-cadherin的表达水平与SKOV-3细胞相比显著降低(P<0.05)，而Vimentin、p-Akt(Thr308)的表达水平较SKOV-3细胞相比明显升高(P<0.05)。（2）SKOV-3/DDP细胞各实验组E-cadherin、Vimentin、p-Akt蛋白的表达水平：SKOV-3/DDP细胞各实验组E-cadherin的表达，DDP组（0.004±0.001）低于LY294002组（0.617±0.016）及LY294002+DDP组（0.285±0.011）(P<0.05)。SKOV-3/DDP细胞各实验组Vimentin的表达，DDP组（0.824±0.012）高于Ctrol组（0.653±0.009）、LY294002组（0.419±0.014）及LY294002+DDP组（0.609±0.100）（P<0.05）。SKOV-3/DDP细胞各实验组p-Akt(Thr308)的表达，DDP组（0.943±0.017）高于Ctrol组（0.748±0.013）、LY294002组（0.431±0.008）及LY294002+DDP组（0.648±0.015）（P<0.05）。SKOV-3/DDP细胞DDP组，与Ctrol组相比，细胞内E-cadherin的表达变化不明显，而Vimentin、p-Akt(Thr308)的表达水平升高；LY294002作用于SKOV-3/DDP细胞， E-cadherin的表达水平明显升高，p-Akt(Thr308)、Vimentin蛋白的表达水平显著降低；LY294002与DDP联合组与DDP组相比，E-cadherin的表达水平升高，Vimentin、p-Akt(Thr308)的表达水平降低。5流式细胞术检测结果：（1）SKOV-3/DDP细胞各实验组的凋亡率：DDP组（5.70±0.17）、LY294002组（5.73±0.42）、LY294002+DDP组（11.86±2.04），三者均高于Ctrol组（0.97±0.11）（P<0.05），且LY294002+DDP组的凋亡率明显高于DDP组和LY294002组，差异有统计学意义（P<0.05），而DDP组与LY294002组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）G0/G1期SKOV-3/DDP细胞数：DDP组（33.10±0.26）、LY294002组（31.70±0.35）、LY294002+DDP组（29.93±0.17），三者均低于Ctrol组（40.70±0.62）（P<0.05）；且LY294002+DDP组（29.93±0.17）低于DDP组（33.10±0.26），差异有统计学意义（P<0.05）；而LY294002+DDP组（29.93±0.17）与LY294002组（31.70±0.35）之间差异无统计学意义（P＞0.05）；S期SKOV-3/DDP细胞数，DDP组（56.20±1.03）、LY294002组（51.80±0.43）及LY294002+DDP组(50.13±1.42)均明显高于Ctrol组（39.10±0.58）（P<0.05）；G2/M期SKOV-3/DDP细胞数， DDP组（10.70±0.10）明显低于LY294002组（16.50±0.12）、LY294002+DDP组（19.94±0.45）、Ctrol组（20.20±0.41），差异有统计学意义（P<0.05），而LY294002+DDP组（19.94±0.45）与Ctrol组（20.20±0.41）之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：1SKOV-3/DDP细胞具有明显的化疗耐药性。2与SKOV-3细胞相比，SKOV-3/DDP细胞表现出EMT现象，细胞形态向间质细胞转化，迁移能力增强，上皮细胞标志物E-cadherin表达下调，间质细胞标志物Vimentin表达上调，同时伴随PI3K/Akt信号通路效应蛋白p-Akt表达水平的升高。而PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可降低SKOV-3/DDP细胞中Akt的磷酸化水平，下调Vimentin的表达水平，上调E-cadherin的表达水平。提示SKOV-3/DDP顺铂耐药可能与PI3K/Akt信号通路异常活化，细胞发生EMT有关，PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可以部分阻滞SKOV-3/DDP细胞的EMT。3PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002能够增强SKOV-3/DDP细胞对顺铂的敏感性，LY294002单独或联合顺铂用药可正性调控SKOV-3/DDP细胞的周期进程，促进细胞凋亡。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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