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MicroRNA相关基因遗传变异与江苏汉族人群肝细胞肝癌易感性的关联研究

作　者: 刘莉
导　师: 范志宁
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科学
关键词: miRNA合成通路单核苷酸多态性肝细胞肝癌 miR-378 HBV
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其中70%-85%属于肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）。据国际癌症研究署（IARC）估计，2008年全球肝癌发病人数达74.8万，居恶性肿瘤发病第六位，肝癌死亡病例约69.6万，居恶性肿瘤第三位。肝细胞肝癌的发病率具有明显的地区差异，中国属于肝细胞肝癌的高发地区，全球55%的肝细胞肝癌病例发生在中国。在我国许多城市如江苏东南沿海地区，肝癌位居全部恶性肿瘤死因的第2位。统计资料显示，我国40岁及以上男性和女性肝癌死亡率分别达到81.2/10万人年和29.0/10万人年，由肝癌的发病和死亡造成的健康威胁导致了沉重的社会和经济负担。在肝癌高发地区建立有效的预防和筛查方法，降低肝癌的发病率和死亡率，是亟需解决的重大公共卫生问题。宏观流行病学研究发现，HBV和HCV病毒感染是最常见的肝细胞肝癌致病因素。研究表明，75%-80%的肝细胞肝癌是由持续的HBV（50%–55%）或HCV（25%–30%）感染引起。据报道全球有20亿人曾经感染过HBV，其中有约3亿感染者发展为慢性感染，然而，仅有一小部分终身携带HBV的慢性感染者最终发生肝细胞肝癌。目前认为，肝细胞肝癌的发生、发展是基因与基因、基因与环境共同调控的复杂过程，而遗传背景的差异可能影响个体在相同暴露因素下对肝癌的易感性。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）被认为是决定个体遗传易感性的重要因素。大量的研究表明基因单核苷酸多态性与多种疾病包括恶性肿瘤发生发展密切相关，然而从候选基因/通路为基础的研究到全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）均注重于传统意义上的蛋白编码基因，对于非编码基因的研究尚处于起步阶段，即使GWAS研究，芯片设计基本上考虑的也是编码基因，非编码序列覆盖的位点较少。近年来，一种非编码的小分子RNA——mircoRNA作为一类新型的癌基因和抑癌基因逐渐被人们所关注，它是一类长度为21-25个核苷酸的非编码小分子RNA，成熟的miRNA整合入基因沉默复合体形成miRISC（miRNA induced silencingcomplex），其通过与靶mRNAs特异性的非完全碱基互补配对，对基因的转录水平和稳定性起着负调控作用，其在肿瘤的发生发展过程中起着不可忽视的作用。mircoRNA首先由细胞核内编码miRNA的基因转录形成初级miRNA（primary miRNA，pri-miRNA），长度为几百到几千个核苷酸，随后pri-miRNA被核内的核酸酶Drosha加工成长约70个核苷酸长度的发夹状前体miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA），再在转运蛋白的作用下被运输到细胞质中，进一步被DICER核酸酶处理成成熟的miRNA。miRNA在生物过程中的行为更像是一个肿瘤的“驱动”，与编码蛋白基因的改变在肿瘤进展中所产生的影响同样重要。迄今为止，已经发现大量与肝细胞肝癌发病相关的miRNAs。例如，mir-378等的表达异常可能与肝细胞肝癌的发生有关，而miR-30c-1、miR-148a及miR-34a等的表达异常则被认为与肝细胞肝癌的进展和预后有关。miRNAs对肿瘤发病的影响可以归因于其自身“质”与“量”的变化，成熟miRNA合成的多少及miRNA本身结构和功能的变化均可能导致其在生物调节过程中的作用的变化，进而与肿瘤的发病相关。因此在miRNA合成和成熟过程中的重要酶和蛋白的相应基因及编码miRNA序列中pre-miRNA或pri-miRNA的单核苷酸多态性改变可能通过影响miRNA的成熟能力和表达水平而与HCC易感性相关。本研究采用分子流行病学和分子生物学的相结合的研究方法从miRNA生物合成通路和pre-miRNA或pri-miRNA两个方面探讨相关基因遗传变异与江苏汉族人群肝细胞肝癌的遗传易感性。本研究结果对于进一步阐明肝细胞肝癌的发病机制和发现与江苏人群肝细胞肝癌遗传易感性相关的基因型，并将其作为分子标志物用于筛选高危人群或易感个体，从而为实施目标明确的个体预防具有重要的理论和实践意义。第一部分miRNA生物合成通路相关基因功能性多态与肝细胞肝癌遗传易感性的研究miRNAs能够以不完全互补的方式与其靶mRNA的3’非翻译端（3’ Untranslateregion，3’ UTR）的特定区域相结合，引起靶mRNAs的降解或者翻译抑制，从而达到负性调节靶基因表达的作用，与多种肿瘤的发生发展相关。在整个miRNA成熟和发挥作用过程中涉及到多个基因，如DICER1、RAN、PIWIL1。这些基因共同作用可能影响miRNA的最终形成和作用过程，而miRNA的正常形成则是miRNA发挥调控作用的必要条件之一。我们推测位于该通路重要基因潜在功能性SNPs改变，可能影响相关成熟miRNA的形成和功能而与江苏汉族人群肝细胞肝癌的易感性有关。本研究采用病例对照研究设计，运用TaqMan基因分型方法，在1300例江苏地区确诊的HBV阳性的肝细胞肝癌病例、经年龄、性别和地区匹配的1344例HBV慢性感染者和1344例HBV一过性感染者对照中分析了DICER、RAN和HIWI基因三个功能性SNP，即DICER（rs1057035）、RAN（rs3803012）和HIWI（rs10773771）与肝细胞肝癌易感性和HBV持续感染的关系。通过双荧光素酶报告基因实验对最终发现的阳性位点进一步进行功能学研究。在调整年龄、性别等因素后，携带DICER1rs1057035CT/CC突变基因型的个体发生肝细胞肝癌的风险较携带DICER1rs1057035TT野生基因型的个体显著降低（调整OR=0.79,95%CI=0.64-0.96），携带RAN rs3803012AG/GG突变基因型的个体发生HBV持续性感染的风险较携带RAN rs3803012AA野生基因型的个体增加了35%（调整OR=1.35,95%CI=1.03-1.77）。同时，与携带PIWIL1rs10773771TT基因型者相比，PIWIL1rs10773771CT/CC基因型的个体发生肝细胞肝癌的风险降低了14%（调整OR=0.86,95%CI=0.73-1.01），同样携带RANrs3803012AG/GG基因型的个体发生肝细胞肝癌的风险较携带AA基因型的个体降低了20%（调整OR=0.80,95%CI=0.61-1.06），接近统计学显著性。并且，这三个位点的保护基因型间存在剂量反应关系（Ptrend=0.001）。为了进一步验证这三个位点是否会影响miRNA的结合，我们进行了双荧光素酶报告基因实验，结果发现三个位点均能改变miRNA结合到基因3’UTR区的能力，从而导致基因表达水平的改变。本研究结果表明，DICER1rs1057035、RAN rs3803012和PIWIL1rs10773771基因多态性位点可能影响江苏人群HBV相关的肝细胞肝癌发病风险。第二部分Pri-miR-378单核苷酸多态与江苏汉族人群肝细胞肝癌易感性的关联研究有研究发现，miR-378可能参与细胞存活，肿瘤生长及血管生成等过程，并与肝细胞肝癌的发生相关。miR-378基因遗传变异可能影响其表达与正常功能。我们推测pri-miR-378上的rs1076064可能影响miR-378的表达水平而与江苏汉族人群肝细胞肝癌的易感性有关。本研究采用病例对照研究设计，运用TaqMan基因分型方法，在1300例江苏地区确诊的HBV阳性的肝细胞肝癌病例、经年龄、性别和地区匹配的1344例HBV慢性感染者和1344例HBV一过性感染者对照中分析了pri-miR-378上的rs1076064多态改变与肝细胞肝癌易感性的关系。并进一步通过双荧光素酶报告基因实验对该位点进行功能学研究。在调整年龄、性别等因素后，与携带AA基因型的个体相比，携带pri-miR-378rs1076064AG/GG突变基因型的个体发生肝细胞肝癌的风险减少了10%（调整OR=0.90,95%CI=0.81-1.00, P=0.047）。为了进一步验证rs1076064是否会影响pri-miR-378的转录，我们进行了双荧光素酶报告基因实验，结果显示rs1076064G等位基因与A等位基因相比具有更高的启动子活性。pri-miR-378上的rs1076064突变基因型可能通过影响pri-miR-378的转录而与肝细胞肝癌的易感性相关。

全文目录

摘要  4-10
Abstract  10-14
前言  14-19
第一部分 miRNA 生物合成通路相关基因功能性多态与肝细胞肝癌遗传易感性的研究  19-47
  前言  19-20
  材料与方法  20-37
  结果  37-44
  讨论  44-47
第二部分 Pri-mir-378 单核苷酸多态与江苏汉族人群肝细胞肝癌易感性的关联研究  47-58
  前言  47-49
  材料与方法  49-53
  结果  53-56
  讨论  56-58
全文总结  58-59
参考文献  59-68
综述  68-84
  参考文献  77-84
附录  84-85
已发表论文  85-87
致谢  87

MicroRNA相关基因遗传变异与江苏汉族人群肝细胞肝癌易感性的关联研究

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