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5-氮杂-2’-脱氧胞苷对肝癌细胞DAPK基因启动子去甲基化的作用

作 者: 谢海
导 师: 余红平
学 校: 广西医科大学
专 业: 流行病学与卫生统计学
关键词: 5-氮杂-2’-脱氧胞苷 肝癌细胞 DAPK基因 启动子甲基化
分类号: R735.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


[研究背景和目的]原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,易转移复发。肝癌的治疗目前仍是以手术为主的综合治疗。化疗是综合治疗的重要辅助手段之一,尤其对不能手术的中晚期患者,也是主要的辅助疗法。但肝癌对化疗不是很敏感。因此,探索新的肝癌治疗靶点和有效的化疗药物具有重要意义。近年研究表明死亡相关蛋白激酶(Death-associated protein kinase, DAPK)基因异常的甲基化参与肝癌的发生发展,靶向DA胱基因甲基化的药物有望成为新的治疗药物。在本研究中我们在肝癌细胞系中进行了以下三个方面的研究:1、探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞增殖的影响。2、探讨5-Aza-CdR对人肝癌细胞株SMMC-7721DAPK基因启动子CpG岛甲基化的影响。3、探讨5-Aza CdR对DAPK mRNA表达水平的影响。[方法]1、细胞培养及药物处理:体外培养SMMC-7721人肝癌细胞株,经传代以后,分别用含有不同浓度(0.5、5.0、50.0μmol/L)5-Aza-CdR的RPMI1640培养液进行培养,并设立不含该药物的对照组。各组细胞分别培养72后,收集细胞用进行于下一步实验;2、用噻唑蓝MTT法检测5-Aza-CdR对SMMC-7721细胞生长的抑制作用;3、采用甲基化焦磷酸测序技术检测药物处理前后各组细胞DAPK基因启动子甲基化的情况;4、采用逆转录PCR法(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测在不同浓度5-Aza-CdR作用下SMMC-7721细胞DAPK mRNA的表达水平;5、采用单因素方差分析的方法分析在不同浓度药物处理下细胞株细胞增殖及DAPK基因mRNA表达水平的差异。采用随机区组设计方差分析分析不同实验组细胞DAPK基因启动子甲基化水平。[结果]1、5-Aza-CdR对SMMC-7721细胞生长有明显抑制作用,并且存在剂量依赖性反应关系(F=242.40,P<0.01);2、发现肝癌SMMC-7721细胞株细胞DAPK基因启动子高度甲基化现象,平均水平为76.71%。经0.5、5.0、50.0μmo1/L三种不同浓度药物处理癌细胞后,各处理组细胞甲基化平均水平分别为78.29%、77.57%、66.00%。随机区组设计方差分析显示,各组间甲基化水平差异有统计学意义(F=39.71,P<0.01)。50.0μmol/L处理组细胞甲基化水平最低,与其它各组差异均有统计学意义(P<0.01),而其它各处理组细胞甲基化水平之间差异均无统计学意义(P>0.05)。3、RT-PCR结果显示,SMMC-7721细胞中DAPK mRNA表达水平很弱。采用不同浓度5-Aza-CdR处理SMMC-7721细胞72小时后,SMMC-7721细胞中DAPK mRNA表达水平呈剂量依赖性逐渐升高(F=360.41,P<0.05)。[结论]人肝癌SMMC-7721细胞株细胞中DAPK基因被高度甲基化修饰,而5-Aza-CdR处理细胞能够逆转DAPK基因启动子区域高甲基化状态,并能明显恢复DAPK mRNA在肝癌细胞株中的表达,从而使SMMC-7721细胞的增殖受抑制。

全文目录


论文縮写词汇中英文对照表  4-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
前言  11-13
1、材料与方法  13-29
2、结果  29-36
3、讨论  36-41
4、结论  41-42
5、参考文献  42-46
综述  46-65
  参考文献  59-65
附录  65-76
致谢  76-77
攻读学位期间发表及待发表的学术论文  77

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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